实验小鼠在癌症研究中的应用及其进展

王 硕，苏 杭，袁经权，缪剑华

(1.广西药用植物研究所姚新生院士重点实验室，南宁 530023；2.广西医科大学，南宁 530021；3.广西中医学院，南宁 530001)

1902～1908年 Jensen［1］使用实验小鼠进行肿瘤移植方面的研究，开始确立了小鼠在癌症研究中潜在的价值。小鼠体型小、繁殖周期短、产仔数多、容易饲养、肿瘤生长迅速，且遗传资源极为丰富。到目前为止，已培育出400多个近交系小鼠，发现了大量突变基因［2-3］。近 20多年来，转基因小鼠［4］、基因敲除小鼠［5］等遗传工程小鼠相继培育成功。小鼠基因组测序工作也已经完成，并且发现，小鼠的基因组和人类基因组序列非常相似，几乎所有人类基因都可以在小鼠身上找到同源基因［6］，由此推断，只要克隆出与人类肿瘤形成有关的基因就可以克隆出小鼠相应的基因，用于人类肿瘤生物学及肿瘤预防、治疗研究。反之，通过研究小鼠基因又可以更加深刻地了解人类基因的功能。在小鼠的基因组中发现并定位了许多癌基因、肿瘤抑制基因，这是其它动物(如果蝇、线虫或大鼠)模型所无法比拟的，决定了小鼠是研究人类肿瘤理想的模型动物。因此，了解小鼠的生物学特性、癌症研究中常用的普通小鼠模型、GEM模型及利用这些GEM癌症模型取得的最新进展等，对研究人类癌症非常有益，本文就这些方面的内容加以综述。

1 肿瘤研究中常用的小鼠模型

1.1 自发和诱发肿瘤模型

自发性小鼠肿瘤模型是指小鼠未经任何有意识的人工处理，在自然情况下产生肿瘤。现有的近交系小鼠中，有许多品系是自发的高癌品系。如AKR小鼠，6～8月龄淋巴细胞性白血病自发率高达70%～80%；C3H/He小鼠乳腺癌发生率在繁殖雌鼠中为97%。使用这些小鼠可以研究人类肿瘤的发生及特性。

诱发肿瘤模型是使用致癌物质或放射线在一定条件下诱发小鼠肿瘤，是实验肿瘤学研究常用的方法。诱发性肿瘤分为物理因子诱导，化学诱导和病毒诱导三类。可能诱发肿瘤的物理因子极多，几乎所有的放射性元素在实验中均能引发肿瘤，尤以放射性超铀元素为最明显。1941年 Loreny和Stewart［7］首次发现用二甲葸或甲基胆葸喂养的小鼠会产生小肠肿瘤，随后人们发现许多化合物均具有致癌性，主要有多环芳烃类、亚硝胺类、偶氮染料及黄曲霉素等，而胆汁酸和手术可为辅助致癌因素，能诱导动物产生肿瘤。可诱发肿瘤的病毒有FB· RFB及鼠肉瘤病毒，Moloney鼠骨肉瘤病毒(MSV)，SV40病毒 (SV40)，郭霍氏杆菌病毒(BKV)等，致瘤率多在80%以上［8］。

自发和诱发小鼠肿瘤模型是在自然条件下发生的肿瘤，其发病特征和人类肿瘤很相似，涉及遗传和环境等因素，理论上讲是很理想的动物模型，对研究人类肿瘤有很高的价值，是研究肿瘤生物学和开发肿瘤预防药物的重要模型。但是因为该模型影响因素多，成瘤时间长，均一性差，病理症状出现较晚，很难定时作对比研究，也有发病率低和稳定性差的问题，不能建立比较精确的用于肿瘤研究和药物筛选的要求规则、整体的模型，且来源较困难，不可能大量获得，故在实验中应用的很少。

1.2 可移植肿瘤模型

小鼠自发瘤可移植性肿瘤模型就是将自发性肿瘤(肿瘤细胞株)移植到同品系、同品种或异种动物体内建立的荷瘤小鼠模型。

同种异体移植是在同种或同系动物身上移植，供体和受体间的共性大，容易在机体内停留及生长繁殖，再现其肿瘤过程。如，用近交系小鼠 L-1210白血病瘤细胞株，接种于同品系小鼠皮下或腹腔，可导致小鼠白血病。目前按此种方法建立的小鼠肿瘤模型用于肿瘤研究的有：小鼠结肠腺癌CT-26，小鼠肉瘤 S-180，小鼠淋巴细胞白血病 L-1210和P388，艾氏腹水瘤，小鼠网织细胞白血病615，未分化胶质瘤G422，黑色素瘤B-16，Friehd病毒白血病，小鼠肝癌H22，小鼠乳腺癌M5076等，在肿瘤研究中具有重要的意义。

同种移植可供选择使用的细胞系或细胞株较多，许多细胞系在世界范围分布广泛，并且这些细胞的生物学特性已经比较明确，一般都有明确的背景资料，使群动物同时接种同样量的瘤细胞，生长速度一致，个体差异较小，成活率高，易于对照观察，早期肿瘤的发生类似自发瘤，特征明显、重复性好，移植的肿瘤细胞生物特性较稳定，这些都是便于科研成果相互比较和交流的有利因素，故成为国内外常用的肿瘤动物模型复制方法之一。但是，可移植的肿瘤细胞株没有遗传背景的改变，它的生长受周围组织影响，与人类自然发生的肿瘤不同，因此，移植瘤模型在筛选作用于实体瘤的药物上需要寻找新的突破。

裸小鼠的发现是人类在癌症研究中的一个重要突破，从此，可以把人类的肿瘤移植到小鼠身上进行研究。在此之前，人类肿瘤只能接种到动物免疫特许的区域，如眼窝、脑内、颊囊等部位，操作不方便，最终还要被排斥。1966年发现的裸小鼠［9］和1983年发现的小鼠严重联合免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)［10］，都是单基因隐性突变形成。裸小鼠无毛、无胸腺，T细胞免疫功能缺陷；SCID小鼠淋巴结、胸腺变小，缺少完成 Ig和 T细胞受体基因重组的功能，因而其T、B细胞免疫功能严重缺乏。因为裸小鼠和SCID小鼠免疫缺陷，人类的肿瘤和免疫活性细胞很容易在它们体内生长而不被排斥。如，将人胎儿的组织移植到SCID小鼠，人组织在SCID小鼠体内保持正常的结构和功能，用这个携带有部分人体组织微环境的“SCID-human”小鼠模型，可以研究人类肿瘤的生长和转移，以及人癌细胞与人体组织环境之间的关系［11］。

裸鼠和SCID小鼠皮下是移植人类肿瘤的理想位置，操作简单，是体内筛选抗癌药物主要选择的部位。目前，人类大多数肿瘤在裸鼠体内移植成功。移植瘤的特性、宿主因素、接种部位、激素和宿主性别的依赖性等都影响人类肿瘤裸鼠移植效果。可能是由于宿主抵制作用(特别是 NK细胞的活性)，裸鼠皮下移植的人类肿瘤很少发生转移和侵袭临近组织，但却保持人类肿瘤的形态和生化特征。在肿瘤异体移植方面，有人认为SCID小鼠是比裸鼠更适合人类癌细胞生长和转移的动物模型，并且在研究人类肿瘤生物学和评估肿瘤治疗方法上有独到之处［12］。

原位移植肿瘤，即将肿瘤细胞移植于与肿瘤原发部位相同的裸鼠脏器内。原位移植动物模型是目前最常用的提高肿瘤自发转移率的模型，因为肿瘤细胞的生长需要同源组织间质细胞的支持［13］，原位移植肿瘤模型中肿瘤的微环境与原来器官相似，所以比单纯皮下移植等非同源一直的转移率高［14］。肿瘤细胞植入皮下等非同源器官很难建立符合人类肿瘤自然转移规律的动物模型，因为非同源组织微环境对肿瘤细胞生长影响较大，而同源组织的微环境对肿瘤细胞生长影响较小。1991年 Fu等［15］利用结肠癌病人的肿瘤标本建立了裸鼠结肠癌原位移植转移模型，1993年 Furukawa等［16］用完整胃癌组织块法建立了裸鼠胃癌原位移植模型，1996年我国学者孙肪宪［17］建立了裸鼠原位移植高转移癌症模型。有些肿瘤只有将其进行原位移植才能表型出转移表型，如人肾癌细胞KG-2细胞接种于裸鼠肾脏时，可以发生肺转移，而接种于裸鼠皮下时则表现转移里丧失［18］。这些研究结果表明接种的微环境对于异质性生长的肿瘤中选择遇有转移能力的细胞亚群具有重要影响。在肿瘤原位移植模型中，组织学完整的肿瘤块原位移植法比肿瘤细胞悬液原位注射法转移发生率高，可信性高［19-20］。原位移植肿瘤模型不仅可以为肿瘤的发生发展机制的研究提供帮助，而且可以更真实地反映抗肿瘤策略的效果。

可移植肿瘤模型应用广泛，因其容易操作，动物成瘤稳定，均一性好，发病率高，成瘤时间差异不大，容易施加干扰因素等特点，仍是目前研究最多的肿瘤模型。

1.3 遗传工程小鼠模型

随着人们对机体分子、细胞生物学特性及遗传工程研究的深人和与之相关的研究方法的改进，以上肿瘤模型不能满足全方位研究肿瘤的需要，肿瘤基因模型应运而至。肿瘤基因模型目前研究使用的主要有以下二种。

转基因肿瘤模型，转基因肿瘤动物模型是指借助基因工程技术将确定的肿瘤外源基因通过生殖细胞或早期胚胎干细胞导入宿主的染色体上，在其基因组内稳定地整合导入的外源肿瘤基因，并能遗传给后代的一类肿瘤动物。1980年，Gordon［4］首次利用雄性前核注射的方法制作成功转基因小鼠，随后，前核注射、逆转录病毒介导的基因转移技术等作为重要基因操作手段在生物医学的各个领域发挥重要作用。正常细胞恶性病变的根本原因在于基因突变，从基因水平研究肿瘤的形成、发展与演进，开创了肿瘤研究的新纪元。分子克隆技术、微注射技术等高科技的出现，为转基因肿瘤动物模型的建立铺平了道路。

基因敲除肿瘤模型，基因敲除是通过同源重组技术将外源基因引入胚胎干细胞，然后将胚胎干细胞注射到胚胎的胚囊中，后代是携带外源基因的嵌合体动物，通过繁殖、选择，可得到纯合带有靶突变基因敲除或基因替换的小鼠［5］。Es细胞打靶技术建立的第一个抑癌基因动物模型是P53-/-小鼠，随后又建立了PgP、hns2、P27KIP、erbB2、Vim、IL-7、ATM等动物模型。这些模型在探讨肿瘤发病机制，诊断、预防及基因治疗等方面起到了不容忽视的作用。

利用转基因和基因敲除技术，几乎可以把所有的变异引入小鼠基因组，包括将基因功能全部去除的全突变或点突变。此外，还可造成复杂的染色体重组，如大区域缺失、转位及倒位［21］。通过小的干扰RNA封闭内源基因的表达，也已经制作成功基因封闭小鼠［22］。转基因技术日新月异，使得我们能够制作出更复杂、更类似于人类癌症发病过程的GEM模型［23-25］。一旦某个人类疾病基因被克隆，很容易组建一个在相应基因中有相同突变的小鼠。由于人类的遗传结构在许多方面和小鼠非常接近，我们把一些重要的与人类癌症相关的基因，利用遗传工程技术在小鼠基因组中作一定的改变，小鼠也因此会发生类似的病理改变，这样的GEM就可以作为研究人类癌症的模型。GEM模型与人类癌症患者的表型有相似之处，可用于研究人类癌症发生、发展、诊断、治疗、新药开发等。

转基因肿瘤模型和基因敲除肿瘤模型建立在离体和在体相结合的基础上，在分子和细胞水平上进行操作，由动物整体水平产生效应，因此使我们更完整的去探讨肿瘤的遗传发病机制、肿瘤细胞与机体之间的免疫学关系、肿瘤的发展演变及凋亡。目前，已经培育了大量的携带人类癌基因、抑癌基因的GEM品系，建立了小鼠肿瘤模型遗传学和病理学资源数据库［3］。

GEM模型在肿瘤研究上具有其它模型无法比拟的优势。如肿瘤在小鼠器官内的形成是自然发生的，不是异体移植的；肿瘤的自然生长率和转移特性与人类相似；肿瘤在自然宿主体内没有免疫原性，克服了宿主对肿瘤的排斥作用。因此，GEM模型比前面几种小鼠模型更适合于人类肿瘤生物学的研究。但是，GEM模型也不能完全真实地模拟人类肿瘤的发生和发展。如，将癌基因导入到小鼠基因组之后，癌基因往往过早的在不止一种细胞类型中过度表达，而人类的癌基因多在中老年后在一种细胞类型中表达、发展成癌。因此，在一些应用研究领域(如抗癌药物筛选方面)，GEM模型还没有得到充分利用。目前很多癌基因及原癌基因本身的定位、结构及其功能尚不清楚，仍然在不断地探索阶段，因此所建立的转基因动物成功率相对较低。这种模型尽管发生率很低，实际操作上也有许多问题尚在探索中，却让我们看到了曙光。

2 小鼠肿瘤模型的局限性

小鼠是啮齿类动物，而人类属于灵长类，二者的遗传关系较远，从小鼠模型得到的结果有时候难以外推到人类。如，Marsoni等［26］分析了 1970～1985年NCI进入Ⅱ期临床试验的75种药物，发现利用小鼠移植肿瘤模型筛选的抗肿瘤药物只有30%在临床上有活性，说明移植肿瘤动物模型并不能很好的反映药物的临床活性。移植肿瘤不是肿瘤的原发部位，而且与宿主组织之间缺乏类似于人类肿瘤和临近组织的相互作用。此外，使用小鼠研究人类肿瘤的局限性还表现在免疫性、感染等方面。由于存在对异体移植肿瘤的免疫性，使得普通小鼠模型在免疫治疗和肿瘤疫苗研究方面应用价值不大。实验小鼠感染的一些病毒(如小鼠肝炎病毒、小鼠肺炎病毒)也可能影响肿瘤接种效果或模型表型变化。种的差异性也是所有动物模型都遇到的问题。有些生物学特性可能不存在种间的交叉性，这就要求使用与人类亲缘关系比较接近的动物(如非人灵长类)模型或者其它系统。小鼠与人类存在着一定的差异，使小鼠癌症模型只能部分反映人类癌症的特性［27］。

3 小鼠肿瘤模型的展望

理想的动物模型应该能良好地模拟疾病的自然状态，并能体现出疾病的主要特点，虽然目前建立的模型较多，但是没有一种模型能完全满足研究者的需要，相对而言GEM模型是目前众多模型中较为理想的模型。

在药物研究方面，一年使用几百万只小鼠筛选抗肿瘤药物的途径可能会被更有效的体外筛选方法所取代。但是，在人类肿瘤研究方面，目前还没有更好的方法能够完全替代动物模型。当筛选出有效的和感兴趣的药物时，进行临床前的动物实验是不可回避的。在克服异体移植肿瘤模型缺陷方面，GEM癌症模型似乎显示了很大的潜力，但能否真正用在抗癌药物的筛选上，还有待于进一步研究［23］。随着制作GEM策略的不断完善，小鼠肿瘤模型将越来越复杂，非侵入的小鼠肿瘤的成像技术是需要研究的重点领域之一。如，用特殊的成像系统，检测基因的表达情况、确定抗癌药物是否到达靶点，以追踪治疗效果等。计算机X射线断层扫描、磁共振成像、正电子发射断层摄影术等已经用在小鼠肿瘤成像上［24］。新的特殊的肿瘤细胞标记技术也在不断发展，如小鼠肿瘤细胞表达绿荧光蛋白，在荧光下可以直接观察到肿瘤细胞［28］。这些成像技术的不断改进，将对研究肿瘤原发部位、肿瘤转移以及药物对肿瘤细胞的作用等带来希望。今后，人类癌症研究最重要的模型仍将是GEM研究重点可能集中在采用更理想的策略开发GEM模型以及模型标准化、模型应用范围扩大等领域。随着研究的深入以及各种技术的完善，人们将逐渐发现肿瘤的发病机制、肿瘤与宿主的关系、肿瘤侵袭与转移过程，从而建立起与人肿瘤疾病更相近的动物模型。

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