非离子氨和亚硝酸氮对虾虎鱼仔鱼的急性毒性及安全浓度评价

林忠婷，李建军，陈 琳，黄 韧

（广东省实验动物监测所，广州 510260）

在循环水养殖系统中，随着饲料等外界氮源的不断加入，养殖水体中无机氮含量不断积累，其浓度往往超过水生动物的耐受值，从而影响鱼类生长速度，甚至导致死亡。养殖水体中的无机氮主要以非离子氨、铵态氮、亚硝酸氮和硝酸盐氮的形式存在，其中非离子氨和亚硝酸氮的危害最大，是制约高密度养殖模式下鱼类正常生长的主要因子之一。

裸项栉虾虎鱼（Ctenogobius gymnauchen）为鲈形目、虾虎鱼亚目、虾虎鱼科、虾虎鱼亚科、栉虾虎鱼属的一种小型海洋鱼类，为广布暖温种，分布于我国沿海，南至琉球、菲律宾一带的礁石或沙泥底质浅水区。因其个体小，性成熟早，繁殖周期短，繁殖力强，便于实验室内饲养管理，广东省实验动物监测所开展了一系列该鱼的实验动物化研究试验［1-3］。鱼类早期生命阶段是其生命周期中对外界环境最敏感的阶段，本试验以裸项栉虾虎鱼仔鱼为试验材料，研究了非离子氨和亚硝酸氮对鱼类的急性毒性，旨在为制订鱼类实验动物环境与质量标准提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

裸项栉虾虎鱼仔鱼，广东省实验动物监测所培育，第九代，7日龄，健康，其来源、孵化及培育参照GB/T 18420-2009《海洋石油勘探开发污染物生物毒性第2部分：检验方法》。

1.2 试验药品及溶液配制

试验用氯化铵（NH4Cl）和亚硝酸钠（NaNO2）为分析纯，购自广州化学试剂厂，试验前用稀释水分别配成4.147 mg/L非离子氨和10.88 g/L亚硝酸氮母液，试验开始时用稀释水稀释成试验所需浓度的暴露溶液。

1.3 试验条件

试验用稀释水为天然海水，经水处理系统过滤和杀菌处理；试验容器为250 m L烧杯，盛试液200 m L，随机放入仔鱼10尾；试验期间用默克水质分析仪（MERCK，型号：NOVA60）监测非离子氨和亚硝酸氮含量，用溶解氧测定仪（YSI 550A）、酸度计（METTLER TOLEDO SevenGo SG2）、电导率仪（METTLER TOLEDO SevenGo SG3）等监测水质，试验水温（25±1）℃、溶氧（6.07～6.77） mg/L、盐度30～31，pH8.0～8.2；试验期间每尾鱼每24 h投喂约500个褶皱臂尾轮虫，每24 h更换试验液一次。

1.4 试验方法

首先根据非离子氨和亚硝酸氮对其它鱼类毒性试验的相关研究及预试验结果设置5个浓度组和一个对照组，非离子氨浓度梯度设置为 0、0.413、0.735、1.309、2.329、4.147 mg/L，亚硝酸氮浓度梯度设置为0、3.0、4.14、5.713、7.884、10.88 g/L，每组设2个平行，暴露后观察记录仔鱼中毒症状及死亡情况，及时捞出死亡仔鱼。

1.5 数据计算

用概率单位法求出非离子氨（NH3）96 h LC50。

［4］，用下式计算其非离子氨浓度（CNH3）：

式中CT为总氨氮浓度；n NH3为非离子氨的物质的量；nN为氮的物质的量，海水 UIA％值查文献［4］表4为 3.4％。即在本试验中，CNH3=CT× 4.13％

参考文献［5］，用下式计算安全浓度SC：

SC=0.1×96 hLC50

2 结果

2.1 中毒症状观察

非离子态氨高浓度组（2.329 mg/L和 4.147 mg/L）和亚硝酸氮高浓度组（7.884 g/L和 10.88 g/L）中的仔鱼在72 h后显得呆滞，游动迟缓；80 h后出现侧游；90 h后最高浓度组（非离子氨4.147 mg/L、亚硝酸氮10.88 g/L）部分仔鱼呼吸困难、体色变白、身体弯曲，最后死亡。非离子氨组与亚硝酸氮组仔鱼死亡情况有所不同，非离子氨组仔鱼死亡时鱼体大多从中间向内弯曲，仔鱼从出现畸形到死亡的过程发展很快；亚硝酸氮各浓度组中的仔鱼死亡前体色渐渐变白，仔鱼从体色开始变化到死亡的过程发展较非离子氨组慢。

2.2 非离子氨和亚硝酸氮对裸项栉虾虎鱼仔鱼的96hLC50及安全浓度（见表1－4）

3 讨论

3.1 非离子氨和亚硝酸氮的致毒机制

表1 非离子氨对裸项栉虾虎鱼仔鱼的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of non-ion ammonia on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表2 亚硝酸氮对裸项栉虾虎鱼仔鱼的急性毒性Tab.2 The acute toxicity of nitrite on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表3 非离子氨对裸项栉虾虎鱼仔鱼的96 h LC50及安全浓度Tab.3 96 h LC50 and safe concentration of non-ion ammonia on larvae of Ctenogobius gymnauchen

表4 亚硝酸氮对裸项栉虾虎鱼仔鱼的96 h LC50及安全浓度Tab.4 96 h LC50 and safe concentration of nitrite on larvae of Ctenogobius gymnauchen

水环境中氨氮的主要来源是含氮有机物经细菌分解、氨化作用而形成的终产物，其次是水生生物排泄的含氮产物，它包含两部分，即离子氨（）和非离子氨（NH3），统称总氨或氨氮，其中非离子氨（NH3）是氨氮中主要毒物［5-9］。当水环境中非离子氨增加时，会抑制生物自身氨的排泄量，使血液和组织中氨的浓度升高，降低血液载氧能力；非离子氨（NH3）半径较小，不带电荷，为亲脂性分子，很容易穿透脂质性生物膜的疏水性微孔进入生物体内，从而对鳃表皮细胞造成损伤，降低鱼的免疫力，甚至直接使鱼类中毒；此外非离子氨能降低鱼类的能量代谢活动，损害其鳃、肝、肾、脾和甲状腺组织，使其出现呼吸困难，分泌物增多，甚至衰竭死亡等一系列生理毒性反应［5，10］。亚硝酸氮是硝化作用与反硝化作用的一种中间产物，能将血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，使血红蛋白（Hb）转变成不能携氧的高铁血红蛋白（MHb），低浓度的亚硝酸氮可降低水生动物的抗病能力［11］，高浓度的亚硝酸氮可抑制血液的载氧能力，严重时会导致鱼类缺氧而窒息死亡［12］，王明学等证实白鲢鱼种血液中的高铁血红蛋白含量随NO2-N浓度的升高而增多［13-14］，此外水生生物的非特异性免疫相关酶对低浓度的铵氮和亚硝酸氮表现出一定的应激反应［15］，抗氧化能力也会受到影响［16-18］。本试验仔鱼死亡前出现身体弯曲、体色变白、呼吸困难等症状，与上述致毒机理是相吻合的。

3.2 氨氮和亚硝酸氮的毒性比较

本试验非离子氨和亚硝酸氮对裸项栉虾虎鱼仔鱼96 h LC50分别为9.1 mg/L和12.405 g/L，明显高于一些鱼类，如非离子氨对真鲷仔鱼96 h LC50为0.28 mg/L［19］、对大菱鲆96 h LC50为1.14 mg/L（溶氧正常）与1.73 mg/L［20］（溶氧过饱和）；亚硝酸氮对真鲷仔鱼（全长6±1 mm）96 h LC50为23.74 mg/L［19］、对大菱鲆的96 h LC50分别为0.13066 g/L（溶氧正常）和0.39078 g/L［23］（溶氧过饱和），其原因除与不同鱼类的品种、体质、生长阶段以及试验环境的温度、盐度、pH、碱度、溶解氧等因素有关外，还可能与裸项栉虾虎鱼为底栖鱼类，对环境胁迫因子具有较强耐受能力有关。非离子氨和亚硝酸氮对裸项栉虾虎鱼的毒性较低，表明裸项栉虾虎鱼作为鱼类实验动物，具有便于实验室饲养与推广的优势。

此外，本试验非离子氨对裸项栉虾虎鱼仔鱼的毒性强于亚硝酸氮，这和其它文献报道的结果一致［14、19、21-23］。

3.3 仔鱼对铵态氮和亚硝酸氮的毒性反应

仔鱼暴露于高浓度非离子态氨和亚硝酸氮中后先后出现呆滞、侧游、呼吸困难、身体弯曲、体色变白等中毒症状，但非离子氨和亚硝酸氮引起仔鱼的反应不同，非离子氨组仔鱼死亡时鱼体大多从中间向腹侧弯曲，仔鱼从出现畸形到死亡的过程发展得很快，而亚硝酸氮各浓度组中的仔鱼死亡体色渐渐变白，仔鱼从体色开始变化到死亡的过程，发展较慢，这种情况与鳜鱼苗对铵态氮和亚硝酸氮的毒性反应基本相似，鳜鱼苗接触高浓度铵态氮和亚硝酸氮后，也出现昏迷、沉落水底，身体弯曲，体色变淡等中毒症状，且同样亚硝酸氮组从体色变浅到死亡的时间较长［14］，大菱鲆对非离子氨和亚硝酸氮也有类似反应［20］。上述情况表明非离子氨和亚硝酸氮除共同影响鱼类血液载氧能力外，其致毒机制存在差异，具体机制差异有待进一步研究。

3.4 非离子氨和亚硝酸氮的毒性影响因素

非离子氨（NH3）和亚硝酸氮的毒性取决于水中pH、水温、盐度、溶解氧等，pH值增高时，NH3的比率增大，pH小于7时，几乎都以NH+4形式存在，pH大于ll时几乎都以NH3形式存在，较高pH值条件下亚硝酸氮的毒性较弱；水温升高时NH3的比率增大，毒性增强；盐度升高时NH3的比率下降，养殖环境中亚硝酸氮的毒性降低；增加溶氧可以影响进入血液的NO2-N数量，提高血液的载氧能力和鱼体对NH3的代谢能力，从而降低了亚硝酸氮和NH3的对鱼体的毒性效应［10、20-21、24］；在 NaNO2溶液中加入CaC12和NaC1，24 h后鱼类死亡率均明显低于对照组，且 CaC12对 NO2-N的解毒作用好于 NaC1［25］，Horst等认为cl-/NO-2的比值可以抑制亚硝酸氮通过鳃浸入血液中，因而会降低亚硝酸氮的“表面毒性”［26］，Tomasso等曾经报道斑点叉尾鲴及硬头鳟对亚硝酸氮的毒性受 Ca2+浓度的影响很大［27］，王明学等也认为CaC12对亚硝酸氮诱导草鱼鱼种血液产生高铁血红蛋白的抑制作用明显高于 NaC1［28］，因此鱼类养殖过程中应注意上述因素的改善。

参考文献：

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