猪细小病毒单克隆抗体的制备和鉴定

张 倩，李晓霞，董昕欣，顾小雪，曹 振，邓小雨，胡冬梅，刘 奇，周 智，遇秀玲，翟新验，田克恭

（1.中国动物疫病预防控制中心，北京 100193；2.北京市朝阳区动物疫病预防控制中心，北京 100018）

猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一［1］。该病常发生在春、秋产仔季节，以怀孕母猪，特别是初产母猪感染后流产、死胎、木乃伊胎及新生仔猪死亡为临床特征，而母体通常缺乏临诊症状［2］。自20世纪60年代中期以来，相继从欧洲、美洲、亚洲等很多国家分离到该病毒或检测出其抗体。我国也先后在北京、上海、吉林、黑龙江、四川、浙江、湖北、河南、山东、福建等地分离到了多株PPV，血清学调查阳性率在12.1％ ～84.8％不等。因该病流行面广、危害严重，给养猪业带来重大经济损失。

目前已经建立了多种检测PPV的方法，包括病毒分离、分子生物学诊断技术、酶联免疫吸附试验等，这些方法在病原检测或抗体检测中各有特点，在该病的诊断中发挥了重要的作用。但如何在此基础上研制开发纯度高、性能稳定的检测试剂以及更易在生产实践中推广应用的快速检测方法仍然是今后猪细小病毒疾病防治工作的一个重点。单克隆抗体以其高度均质性、高度特异性，来源稳定等特点［3］，可直接运用于疫病的临床诊断，尤其是临床疑似病例的病毒抗原检测，也可作为原材料广泛应用于多种诊断方法。本文旨在制备生物活性好、抗体分泌稳定的抗PPV的单克隆抗体杂交瘤细胞株，为猪细小病毒病的临床快速诊断商品化试剂研发奠定基础。

1 材料和方法

1.1 毒种、细胞和实验动物

PPV、猪肾细胞（PK-15）和 SP2/0细胞（Sp2/0-Ag14）均购自美国标准菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒I型（PCV-1）、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）、乙脑病毒（JEV）均为中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室保存。SPF级BALB/c小鼠购自中国药品生物制品检定所实验动物中心［SCXK（京2005-2004）］。

1.2 主要试剂

DMEM培养基（GIBCO公司）、HAT（Sigma公司，货号 H0262）、HT（Sigma公司，货号 H0137）、HRP标记的羊抗鼠 IgG（JacksonImmunoResearch，Inc）、HRP标记的羊抗鼠 IgM（Jackson Immuno Research，Inc）、FITC标记的抗鼠 IgG（Sigma公司）、 FITC 标记的抗鼠IgM（Sigma公司）、SBA Clonotyping System/AP kit单抗亚型鉴定试剂盒（Southern Biotechnology Associates，Inc.）。

1.3 病毒增殖与纯化

在PK-15细胞传代后接种PPV，置于37℃5％ C02培养箱中进行培养，待75％以上细胞出现细胞病变（CPE）后收毒，收获的病毒冻融处理3次，然后用聚乙二醇（PEG）浓缩，再经差速离心，最后用蔗糖梯度密度离心纯化［4］。

1.4 免疫

用纯化的PPV与等量的弗氏完全佐剂混匀后，腹腔和背部皮下多点注射SPF级BALB/c小鼠（6～8周龄、雌性）。此后，每间隔两周用混合弗氏不完全佐剂的抗原液进行加强免疫。两次加强免疫后，于融合前3天，脾脏或腹腔注射200μg抗原液加强免疫。

1.5 间接ELISA筛选方法的建立

采用间接ELISA方法，按方阵法确定包被PPV纯化蛋白抗原、抗体的最适工作浓度。以TMB为底物，测定OD450值。以阳性血清 OD值在1.0左右，同时与阴性血清OD值差距最大的抗原包被浓度、抗体稀释度为最佳工作浓度。

1.6 细胞融合［3］

将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞按5∶1比例混合，在50％聚乙二醇作用下融合，融合后置HAT选择性培养基，将其加入到铺有饲养细胞的96孔培养板中，置37℃5％CO2培养箱中培养。

1.7 阳性杂交瘤细胞的克隆化［5］

对融合后的阳性细胞用有限稀释法进行4次克隆，使阳性率达100％。将最终筛选出的强阳性单克隆细胞扩大培养，一部分冻存备用，一部分用于大量制备单克隆抗体。

1.8 单克隆抗体的制备及纯化

取8～12周龄SPF级BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，所得腹水用亲和层析法进行纯化。

1.9 单克隆抗体的鉴定

1.9.1 杂交瘤细胞染色体分析［6］

按常规方法进行杂交瘤细胞染色体分析，于高倍显微镜下观察，每份样本应计数100个完整的中期核细胞，记录染色体数目的分布。

1.9.2 单克隆抗体效价及亚型的测定

采用已建立的间接 ELISA方法测定细胞上清及腹水中单克隆抗体的效价。按照SBA Clonotyping System/AP kit单抗亚型鉴定试剂盒说明书进行单克隆抗体亚型的测定。

1.9.3 单克隆抗体特异性鉴定

1.9.3.1 交叉反应：以PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV为包被抗原，用腹水分别与其进行交叉检测，用间接ELISA方法测定OD450nm值。

1.9.3.2 免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）：用PPV同步接种含 PK-15细胞的 96孔培养板，置37℃ 5％CO2培养箱中培养48h后用-20℃无水乙醇固定。按方阵法确定的腹水、HRP标记羊抗鼠IgG （IgM）的最佳工作浓度和反应时间进行IPMA检测，经AEC进行底物显色，苏木素衬染细胞核后，于显微镜下观察。

1.9.3.3 间接免疫荧光检测方法（IFA）：细胞板的制备和固定同 1.9.3.2。按方阵法确定的腹水、FITC标记羊抗鼠IgG（IgM）工作浓度和反应时间进行IFA检测，于荧光显微镜下观察。

1.9.4 杂交瘤细胞稳定性鉴定

获得的2个细胞株经稳定传代后液氮冻存，1个月后复苏，检测细胞上清抗体效价。再经腹腔接种BALB/c小鼠，同样检测腹水的抗体效价，并与冻存前效价进行比较。

2 结果

2.1 病毒增殖与纯化

经蔗糖梯度密度离心纯化后的PPV蛋白浓度为11 mg/m L。

2.2 间接ELISA方法筛选建立杂交瘤细胞株

根据方阵法确定间接ELISA方法的最佳 PPV纯化蛋白抗原包被浓度为2μg/mL，经间接 ELISA筛选，4次克隆化获得2株稳定分泌抗PPV单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为2H9、1F9。

2.3 单克隆抗体的鉴定

2.3.1 杂交瘤细胞染色体计数

杂交瘤细胞染色体在90～110范围内变化，2H9平均98，1F9平均96。该数值大于脾细胞染色体数的两倍，小于脾细胞与骨髓瘤细胞的染色体数目之和，表明该杂交瘤细胞确为脾细胞与骨髓瘤细胞融合产物。

2.3.2 单克隆抗体效价及亚型测定

2H9、1F9杂交瘤细胞上清的 ELISA抗体效价均在104以上，腹水的ELISA抗体效价均在107以上。2H9的亚型是 IgG1、kappa链；1F9的亚型是IgM、kappa链。

2.3.3 单克隆抗体特异性鉴定

2.3.3.1 交叉反应：间接 ELISA检测结果显示，PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV均不与2H9和1F9腹水发生交叉反应。

2.3.3.2 免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）：腹水1∶400稀释，HRP标记的羊抗鼠 IgG（IgM）1∶80稀释，AEC显色时，2株单克隆抗体均能与PK-15细胞中的PPV呈中等强度以上反应，可见接种了PPV的PK-15细胞核或细胞浆中出现红色阳性着染，阴性对照细胞未见阳性反应（封底图1）。

2.3.3.3 间接免疫荧光方法（IFA）：腹水1∶400稀释，FITC标记的羊抗鼠 IgG（IgM）1∶100稀释时，2株单克隆抗体均能与PK-15细胞中的PPV呈中等强度以上反应，可见接种了PPV的PK-15细胞核或细胞浆中出现黄绿色荧光，阴性对照孔呈暗红色未见荧光（封底图2）。

2.3.4 杂交瘤细胞稳定性鉴定

2株杂交瘤细胞经稳定传代后液氮冻存，1个月后复苏，细胞生长良好，抗体分泌水平与冻存前相同。腹腔接种BALB/c小鼠后可致瘤，并稳定地分泌特异性抗体。

3 讨论

本研究克隆、筛选、鉴定了2株针对PPV的杂交瘤细胞，经鉴定证明其分泌的单克隆抗体生物活性好、特异性高、抗体分泌稳定，能大量制备，可作为纯度高、性能稳定的检测试剂原材料，也可用于PPV检测商品化试剂盒的研发，具有广阔的市场应用前景。

本研究通过对杂交瘤细胞克隆化这一关键步骤的把握，使得所制备的单克隆抗体具有阳性克隆多、稳定性好的特点。首先在细胞融合后长至孔底的1/2～1/3时进行克隆，避免了阳性细胞漏检和染色体丢失情况的发生。采用操作简便的有限稀释法，保证了获得的杂交瘤稳定，抗体分泌效价高。经过4次克隆化获得的杂交瘤阳性率均为100％，ELISA检测证明2H9、1F9交瘤细胞上清效价均达1∶1×104，腹水效价均达1∶1×107。此外，本研究以纯化的PPV全病毒作为免疫原，同时在间接ELISA的筛选过程中设立了PK-15细胞的阴性对照，以确保得到特异性强、活性好的单抗。特异性试验证明2H9、1F9具有高度的特异性，只与 PPV反应，与PRRSV、CSFV、PRV、PCV-1、PCV-2、JEV等相关猪病病毒均无交叉反应。

目前大部分研究制备的 PPV单抗多经由ELISA方法筛选得到，并用于 ELISA抗体检测，如1992年陆萍等获得3株抗PPV McAbs的杂交瘤细胞株［7］；1993年余太尉筛选出 4株分泌抗 PPV McAbs的杂交瘤细胞系，并用以建立检测PPV抗体的ELISA［8］；1995年谢琴等得到5株分泌抗 PPV McAbs，用以建立检测 PPV的 ELISA方法［9］等。而本研究获得的2株单克隆抗体不仅ELISA效价高，且同时经IPMA和IFA方法验证，均能与接种于PK-15细胞的PPV发生特异性反应，具有良好的免疫酶活性和荧光活性，因此应用范围更广，不仅可用于建立ELISA方法进行PPV抗体或抗原检测，还可用于建立简单、快速、特异、敏感的IPMA和IFA检测方法。下一步，将利用本研究制备的2株PPV单抗建立免疫酶和免疫荧光方法，并应用于可疑的流产和死产胎儿的肾、肺、肝、脑、睾丸和胎盘等临床样品冰冻切片的检测，作为PCR等猪细小病毒病临床快速诊断方法的补充和验证。Infect Dis Rev，2000，2：99-109.

［2］吴丹，仇华吉，李昌文等.猪细小病毒sY一99株非结构蛋白NSl基因的克隆及序列分析［J］.哈尔滨中国预防兽医学报07-2002.

［3］徐志凯.实用单克隆抗体技术［M］.西安：陕西科学技术出版社，1992.

［4］殷震，刘景华主编.动物病毒学［M］.第二版.北京：科学技术出版社.1997，310-318

［5］James W.Goding.Monoclonal Antibodies：Peinciples and practice.Academic press.Inc.Ltd.1983

［6］鄂征主编.组织培养和细胞生物学技术（第一版）［M］.北京：北京出版社.

［7］陆萍，胡志贤，王国丰，等.抗猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步应用［J］.上海农学院学报，1992，10 （2）：101-107.

［8］俞太尉，丘惠深.抗猪细小病毒单克隆抗体的研制及初步应用的研究［J］.中国畜禽传染病.1993，1：55-57.

［9］谢琴，王东，何存利，等.分泌猪细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立［J］.中国畜禽传染病.1995，5：48-50.