营养与病毒感染性疾病动物模型

窦建琳，张宏福，唐湘方

（1.兰州大学基础医学院病原生物学研究所，兰州 730000； 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100093）

疾病动物模型的开发与应用是转化医学研究的基本保障，也是比较医学研究的重要领域。胜任动物模型是研究疾病发病机制的重要工具，也是研发和评价疫苗及药物的重要实验平台。SARS、高致病性禽流感、甲型流感、登革热、手足口病等新现病毒性疾病的爆发流行已成为了全球性的重大公共卫生问题，而对于它们的研究都受到同一难题的制约：缺乏胜任疾病动物模型。

引起上述疾病的病毒以人为其重要或者唯一的自然宿主，非人灵长类动物于是就成为建模的首选。虽然有较为成功的案例［1］，但是非人灵长类动物的正常体温高于人类的正常体温，用以建模的温度敏感突变株在人体内无法增殖。另外，灵长类动物来源稀少，该类模型因而经济性欠佳，无法保障对其可重复性的验证，并且与当前重视保护动物权益的要求有所背离。

普通啮齿类动物对于上述病毒的易感性较低，驯化病毒以提高毒力和通过对实验动物进行基因操作以影响其疾病易感性是当前的主流应对策略［2］。人源化 NOD/SCID小鼠是研究发病机制和信号传导的优秀模型，但因其免疫功能缺陷，不能直接用于抗病毒药物的药效学研究和疫苗的评价。应用基因敲除或者转基因动物建模面临的主要问题还有：靶点基因的筛选具有难度；易感性相关基因参与免疫、信号传导、血管发生等功能，敲除可能具有致死性；敲除或转基因动物建模特异性欠佳，可能会出现非特异病理变化。另外，基因敲除使靶基因的表观遗传机制难于研究，而宿主的表观遗传机制也是其病毒易感性的重要构成部分［3］。

疾病动物模型最重要的特征是替代复制性［4］，即充分再现人类疾病的临床表现和病理特征，并尽可能符合自然感染途径及免疫状态。符合上述特征的动物模型不仅有利于发病机制的研究，同时也是评价疫苗和抗病毒药物的主要平台。在普通啮齿类动物构建胜任的病毒感染模型不但是疾病防控的需求，也是动物实验应用中“3R”（reduction减少，replacement替代及 refinement优化）原则的体现。

本文通过文献回顾，认为营养干预可有助于在啮齿类动物建立新现病毒的胜任感染模型；营养涵盖范围广泛，本文着眼于维生素如维生素D及维生素A、微量元素如硒、锰及肠道菌群与宿主疾病易感性和病毒进化的关系，以期发现解决相关难题的线索。

1 营养与宿主易感性

营养代谢性疾病可增加个体对病毒的易感性，1型糖尿病患者感染肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）、柯萨奇病毒等肠道病毒的风险约是其它人群的10倍［5］；巧合的是，在NOD/SCID（非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷）小鼠可构建较为成功的EV71感染模型［6］。这提示宿主的营养状态与其疾病易感性关系密切。

营养是宿主抵抗力的主要决定因素之一，营养不良通过削弱宿主的免疫防御功能，从而提高病毒感染的风险［7］。蛋白质、糖类、脂类及核酸等参与免疫系统的发育及正常免疫功能的维护［8］，因此这些基本营养成分的变化常导致普遍易感性上升。而维生素、微量元素、益生菌等特殊营养成分与特定的病毒易感性相关联［9］。维生素 D的状态与HIV的疾病进程有密切关联［10］，提高活性维生素D的血清浓度可显著减低急性呼吸道病毒感染的发病率［11］。柯萨奇病毒感染硒缺乏的动物可构建成功的克山病动物模型［7］。

过度营养与感染性疾病的关系也非常密切，过度营养及营养不良的登革热患者症状均较严重［12］，但营养对宿主登革易感性的影响缺乏相关研究。另外，在动物实验中，过量补充ω-3脂肪酸可削弱宿主对胞内寄生病原的抵抗力［13］。

2 营养变化与易感性的机制

营养导致宿主疾病易感性的变化很大程度上是通过影响免疫功能来实现的，但是营养成分也可直接干预病毒的毒力、作用于病毒的进化。

2.1 营养与病原毒力及进化

砷能够影响病毒的复制和抑制感染［14］，而硒与病毒的感染关系也十分密切。在低硒饮食的实验动物，柯萨奇病毒和流感病毒的毒力得以增强；单纯疱疹病毒1型却在高硒状态下毒力更强。不同病毒对硒的不同反应证实硒可直接影响病毒的毒力。上述弱毒株在硒缺乏的小鼠转变为毒力株时，病毒基因会发生变异，出现毒力决定基；如果敲除硒谷胱甘肽过氧化物酶基因，实验动物感染病毒时也有类似的表现。因此营养直接与病毒进化相关，也是新生病毒出现的原因之一［7，15］。究其原因，可能是因为微量元素是病毒RNA多聚酶发挥活性的保障，同时RNA多聚酶也是病毒变异的“热点”，微量元素的变化促进了病毒的变异和进化。柯萨奇病毒及流感病毒的RNA多聚酶活性依赖于硒，而EV71的RNA多聚酶活性依赖于锰［16］，提示可通过干预锰的含量来提高宿主对EV71的易感性，如同在硒缺乏的动物构建克山病动物模型一样来开发良好的手足口病模型。上述结果也显示了营养干预有可能取代基因敲除用于开发病毒感染动物模型。

2.2 营养与粘膜免疫

免疫细胞功能旺盛、代谢活跃，对于营养的变化较为敏感。营养变化对固有性及适应性免疫功能均可产生影响，由此可调节宿主对非胃肠道及胃肠道途径传播病毒的易感性。营养摄入的重要途径是经消化道吸收，消化道也正是粘膜免疫发挥作用的重要场所，通过影响粘膜免疫，营养因而可更直接地干预肠道病毒的感染。

粘膜免疫的物质基础包括屏障结构、分泌型IgA及重要的免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞、CD8ααT细胞等；而屏障结构中除了有肠上皮构成的物理屏障、消化液参与构成的化学屏障外，肠道菌群也参与构成生物屏障。粘膜免疫与免疫耐受的动态平衡维持了对食物的口服耐受，确保营养的摄入；在清除病原微生物的同时，使共生或益生微生物能够长期定居［17］。活性维生素通过其受体调节使肠道内淋巴组织的T细胞归巢，这一作用受抑制后，肠粘膜淋巴结 CD8ααT细胞数目减少，导致IL-10分泌水平降低，从而对共生菌产生免疫应答［18］。维生素A可通过维甲酸受体活化树突状细胞从而改善粘膜免疫［19］。而肠道菌群通过转录因子NF-κB及相关信号传导通路与粘膜免疫相互作用，从而调节肠道屏障的完整性［20］。

肠上皮由单层上皮细胞组成的，是肠腔内食源性成分、微生物与免疫系统相互作用的界面。细胞间有由紧密连接蛋白与肌动蛋白组成的紧密连接，通过它可调节肠道屏障的通透性。肠道微生物通过影响胞内信号传导，改变紧密连接蛋白的表达和分布，共生或者益生菌可增加细胞周边的紧密连接蛋白含量；食物某些成分亦可通过紧密连接蛋白调节肠道屏障的通透性［21］。随着粘膜免疫与免疫耐受的平衡紊乱，免疫耐受被打破，物理屏障遭到自身抗体及自身反应性T淋巴细胞的破坏；对共生菌及益生菌产生的免疫应答，不但直接削弱生物屏障作用，而且也导致了共生菌及益生菌对物理屏障调节作用的下降；益生菌参与食物的消化及营养的吸收，其被清除，导致具有肠屏障调节作用的营养成分摄入下降，进一步加重了肠道屏障的破坏程度［22，23］。上述过程直接增加了宿主对肠道病毒的易感性。

综上所述，营养与粘膜免疫的相互作用可影响宿主的病毒易感性，尤其对于肠道病毒更具有直接的影响，因此通过营养干预构建胜任的EV71等肠道病毒感染动物模型就有高度的可行性。另外，肠道菌群是粘膜免疫的重要组成部分，无菌或悉生动物因肠道无菌群或与普通动物不同，因此基于它们的模型并不能充分反映病毒的自然感染途径和移行。

3 营养方式与动物模型

营养可通过双向性、剂量依赖效应及病原依赖等方式影响疾病易感性，营养不良及过度营养都可能提高宿主的疾病易感性［24］。对于宿主病毒易感性产生影响的营养成分众多，并且微量元素及维生素等的变化精细，因此需要通过新的营养方式保证营养成分较精确地摄入。另外，感染导致的免疫功能变化反馈调节瘦素，通过影响食欲使摄食量发生变化［25］，从而营养摄入发生变化，免疫功能及易感性随之又发生变化，建模动物的营养、免疫及易感性实质处于不稳定的状态。因此营养是动物模型有效性发挥的前提，实验动物营养状态均质化可缩小为消除误差而设置的样本规模，从而降低实验动物的消耗。值得注意的是，营养、免疫与感染的相互作用还可导致疾病严重程度的改变［12］，因此在药物和疫苗评价时，如果无法保障实验动物的营养背景均质，则可能导致失真结果的出现。因此，在动物模型开发和应用的全程，均应保证实验动物的营养状态均质。

实验动物的营养方式主要有自由取食和强制营养。稳定营养的前提是等量摄入成分一致的饲料，自由取食很难保证。强制营养可保证定量摄食，但与自主咀嚼相比，它不仅抑制营养物质的吸收，还可降低实验动物的生存率［26］。应用自愿营养模型或者配方饲料手工喂养是克服上述缺点的有效手段［27-29］。定量摄食是营养均质化的开端，开发二代营养模型可提供进一步的保障。亲代包括母系及父系都对后代的营养状态产生重要影响，并且包括营养在内的环境因素造成的表观遗传变化也能通过哺乳动物的生殖而遗传［30，31］，因此在亲代应用自愿营养法就有可能获得营养状态均质、稳定的子代。在此二代营养模型的基础上进行病毒感染模型的构建，将有助于当前难题的克服。

4 结语

在新现病毒性疾病的研究中，缺乏胜任动物模型是重要的限制“瓶颈”。除了应用不依赖于动物实验的研究方法外［32］，通过营养干预宿主的病毒易感性以建立符合“3R”原则并可充分再现人类疾病特征的动物模型具有可实践性。

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