阿尔茨海默病中miR-29c对APP表达调控的初步研究

宗园媛，朱 华，王海林，徐艳峰，马春梅，代小伟，黄 澜，李晓颖，董 伟，张连峰，秦 川

（卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 10021）

阿尔茨海默病（A lzheimer's disease，AD）是老年人最常见的中枢神经系统退行性疾病。主要三大病理变化是神经细胞外老年斑沉积、神经元内神经纤维缠结和神经元缺失等［1］。microRNA的出现为AD的发病机制研究提供了新的思路。microRNA （微小RNA，简称m iRNA）是生物体内源长度约为20～23个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制［2-4］。许多miRNAs在神经系统中特异表达或大量表达，其参与了神经分化，突触可塑性及记忆形成［5］。目前国际上已有多篇文献证实miRNA与包括阿尔茨海默病在内的多种人类神经系统疾病密切相关［6-8］。本实验为了探讨miRNA在阿尔茨海默病发生发展过程中的作用，我们采用了miRNA芯片检测3月龄、6月龄APP/PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型大脑中miRNA表达情况，并通过实时定量 PCR证实m iR-29c在3、6、9月龄小鼠中表达明显升高，通过体外细胞水平研究证实 miR-29c可以减少 APP蛋白的表达，丰富了m iRNA与阿尔茨海默病之间的相关性研究，为阿尔茨海默病发病与治疗研究提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

APPswe/PSΔE9双转基因 C57BL/6J小鼠由本所遗传中心提供，启动子为mPrP promoter。APPswe是“瑞典家族”突变，突变发生在 APP编码序列 N端的670，671位点的赖氨酸与甲硫氨酸分别被天冬酰氨与亮氨酸取代。PS1ΔE9是在家族性AD中发现的PS1基因第9外显子缺失。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准（GC-07-2053）。

1.2 APPswe/PSΔE9转基因小鼠大脑 microRNA芯片检测

我们之前的研究中［9］已经阐述了利用3、6月龄APPswe/PSΔE9转基因小鼠送LC Sciences公司进行microRNA芯片的检测，miRNA探针序列信息来自于Sanger miRbase Release 9.2版本数据库，每种探针至少重复3次。杂交使用Cy3、Cy5荧光标记。芯片及探针合成经过质量控制。3月芯片探针总数为737，6月芯片探针总数为1094。数据处理和分析首先是扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然后通过 LOWESS（locally-weighted regression）过滤进行标准化。对于双色标记实验，将计算两种检测信号的比值（log2）和t-test的P值，以P＜0.01定义显著差异性表达。选用组织内源的 5S rRNA作为m iRNA芯片的内源阳性对照。阴性对照包括针对LC Sciences人工合成序列的单碱基错配探针外，还设计了两组探针：一组是空白对照，另一组是与实验样品无同源性的核酸序列探针。

1.3 realtimePCR检测验证 APPSWE/PS1ΔE9双转基因AD小鼠模型大脑皮层及海马中microRNA的表达水平变化

选用3、6、9月龄APPswe/PSΔE9转基因小鼠各6只，利用 Ambion RNA提取试剂盒提取小鼠组织富含miRNA的总RNA，利用德国QIAGEN公司real time PCR试剂盒检测m iR-29c的表达情况。引物序列：正义：TAGCACCATTTGAAATCGGTT，反义：GAATCGAGCATCAGTTACG。PCR产物80 bp。以U6snRNA为内参。用delta-delta C（t）的方法和 ttest对数据进行分析和统计学处理，以P＜0.05定义显著差异性表达。

1.4 miR-29c表达载体构建及高表达 miR-29c细胞系的建立

在sanger miR数据库 http：//m icrorna.sanger.ac.uk/中检索 miR-29c碱基序列，合成 64 bp的oligo互补双链。利用 invitrogen公司的 pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR线形载体构建 m iR-29c表达载体，筛选阳性克隆送测序。选用正确表达 miR-29c的克隆提取质粒。利用脂质体法转染SH-SY5Y细胞，利用 Blasticidine进行阳性克隆的筛选，检测m iR-29c的表达情况，构建高表达 m iR-29c的稳定转染细胞系。

1.5 miR-29c靶基因的预测

本实验综合分析了TargetScan、miRBase、miRanda、PicTar四个数据库。只有miRBase预测了m iR-29c可与APP的结合，结合位点位于APPmRNA3’UTR 1068～1089 bp。

1.6 hAPPcDNA质粒与miR-29C质粒共同瞬时转染

NCBI上公布的人APP基因的转录产物共有3种，命名为APPmRNA1-3，经BLAST比对发现3种转录体mRNA的3’UTR序列完全一致。APPcDNA载体（购自美国Qrigene公司，包含全长3’UTR，总长1.1 kb，NM_201413.1）与 miR-29c表达载体共转染到24孔板中的 HEK-293T细胞中，重复2个孔。48 h后，提取细胞总蛋白，Western blot检测APP蛋白的表达情况，以同时转染miR阴性对照质粒及APPcDNA载体为对照。

1.7 Westernblot

分别自鼠脑及细胞中提取总蛋白。脱颈椎法牺牲小鼠，取小鼠海马及其上皮质脑组织（约 80 mg）取出迅速置研磨器中，放入匀浆器内，加入1 mL RIPA裂解液及10μL PMSF，充分研磨。细胞总蛋白提取时每6孔板加入300 uL RIPA裂解液，3 uL PMSF用枪头吹打后，吸入1.5 m LEP管中。分别冰上静置30 m in，使蛋白彻底的裂解，4℃，14000 g离心30 m in。利用 BCATMProtein Assay Kit对提取的蛋白进行浓度的测定。总蛋白上样量20 ug，10％ SDS-PAGE上分离，300 mA电转移1.5 h到NC膜上，室温下5％脱脂奶粉/TBS封闭1 h。APP单克隆抗体（6E10，Sigma）1∶200稀释，4℃过夜孵育。第二天TBST洗膜3次，每次10 min。1∶25，TBST稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗及辣根过氧化物酶标记的β-actin（用于控制蛋白上样量，作为内参照）。室温下振荡孵育1 h。TBS-T漂洗3次，每次10 m in。利用化学发光剂（Santa Cruz），暗室使胶片曝光。

1.8 双荧光素酶报告检测

PCR扩增APP的全长3’UTR（总长约1.1 kb，包含与m iR-29c的预测结合位点并带XhoI和NotI两个酶切位点），将PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体，命名为 T-APP3’UTR。根据 m iRBase预测，miR-29c与APP的结合位点位于APPmRNA 3’UTR 1068～1089 bp，据此我们构建了利用点突变方法构建APP3’UTR突变载体，命名为T-APP3’UTRmut。psiCHECKTM-2载体（Promega）含有两种荧光素酶：萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。将所构建的TAPP3’UTR，T-APP3’UTRmut载体进行XhoI和NotI双酶切，将野生型及含有突变位点的APP3’UTR克隆psiCHECKTM-2载体的海肾荧光素酶开放读码框架的下游，构建含APP3’UTR及突变的APP3’UTR的荧光素酶报告载体，分别命名为 pAPP3’UTR，pAPP3’UTRmut。将所构建的荧光素酶报告载体与m iR-29c表达载体或者阴性对照载体共转染 HEK-293T细胞，转染后48 h，利用双荧光素酶报告检测试剂（Promega）及荧光素酶活性检测仪检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，并将海肾荧光素酶的活性用萤火虫荧光素酶的活性进行标准化，比较荧光强度的变化。

2 结果

2.1 microRNA芯片及realtimePCR验证结果

根据miRNA芯片结果筛选出一种在3、6月龄APPSWE/PS1ΔE9双转基因小鼠大脑及海马中表达均有差异的 miRNA，即 miR-29c。利用 real time PCR检测其在3、6、9月龄APPSWE/PS1ΔE9大脑组织中表达增高（图1）。

2.2 Westernblot检测在SH-SY5Y细胞系中APP表达情况

我们成功构建了高表达 m iR-29c的稳定转染SH-SY5Y细胞系。利用 real time PCR检测稳转m iR-29c细胞系中m iR-29c表达增加1.8倍。

Western blot结果显示高表达 miR-29c的稳转SH-SY5YX细胞系，APP蛋白表达较转染阴性对照载体的稳转SH-SY5YX细胞系减少22％（图2）。

2.3 Westernblot检测在 HEK-293T细胞系中APP表达情况

图1 3、6、9月龄APPSWE/PS1ΔE9大脑组织中miR-29c表达情况的 real time PCR结果Fig.1 Relative quantity ofmiR-29c in 3，6，9-month-old APPSWE/PS1ΔE9 mice by real time PCR result注：“*”P＜0.05Note：“*”P＜0.05

图2 高表达m iR-29c的SH-SY5Y细胞系中APP蛋白表达水平分析Fig.2 APP protein expression in overexpression ofmiR-29c SH-SY5Y cell line

APPcDNA载体与miR-29c表达载体共转染到24孔板中的HEK-293T细胞中，48 h后发现实验孔与对照孔转染效率均约为70～80％。提取细胞总蛋白，总蛋白上样量20 ug，以β-actin为上样量内参照。Western blot结果显示m iR-29c组细胞内 APP蛋白表达明显减少，平均减少50％。试验重复2次，结果一致。

图3 miR-29c与APPcDNA共转染HEK-293T细胞实验结果Fig.3 APP protein expression in m iR-29c expression vector and APP cDNA vector transient transfection HEK-293T cell line

2.4 双荧光素酶报告检测实验结果

荧光素酶报告载体与miR-29c表达载体或阴性对照载体共转染至HEK-293T细胞中，转染后48 h，收集细胞。所有的实验均重复3次。荧光素酶活性检测仪分别检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性，并且用萤火虫荧光素酶的活性对海肾荧光素酶的活性进行标准化。与阴性对照相比，pAPP 3’UTR，pAPP 3’UTR mut与miR-29c共转染，标准化后海肾荧光素酶的活性均没有明显变化。

3 讨论

APP是淀粉样前体蛋白，广泛存在于全身组织细胞中，在脑中表达较高。APP属于I型跨膜蛋白家族成员。APP属于进化过程中保守的蛋白家族，主要有APP695，APP751，APP770三种形式存在［10］。目前在家族性AD病人中已鉴别出多个APP基因的突变位点，这些突变使得APP代谢途径发生异常，虽然只有近1％的EOFAD与APP突变有关。但APP蛋白代谢产物Aβ是阿尔茨海默病中最重要病理学特征-老年斑的重要组成物质，将人突变 APP基因转入小鼠后，出现与人类阿尔茨海默病人相似的征状和体征，如老年斑、学习记忆能力异常下降，说明突变的APP基因使小鼠脑中的APP蛋白表达异常增高，可导致APP蛋白代谢产物Aβ大量的积累，以上原因使APP基因在阿尔茨海默病中占有非常重要的地位和意义［11］。最初发现 APP是在 AD中，目前APP的生理功能还未完全明了，认为APP与神经系统的发育分化，神经突触的可塑性有关。研究表明 APP经 γ-分泌酶复合体水解产生的AICDs，参与细胞内基因转录，细胞动力学及细胞凋亡［12］。

已有研究发现多种m iRNAs可在阿尔茨海默病中对APP起调控作用。例如，2009年 Hébert等人发现阿尔茨海默病人大脑中 miR-106b降低促进APP表达增多，并证实miR-106b可在细胞内直接结合APP mRNA 3’UTR，但没有确定结合位点［13］。2010年 Wei Liu等人在早老小鼠 SAMP8中发现m iR-16可下调APP表达［14］。2011年 Justin等人证实在细胞水平 m iR-101可内调节 APP的表达［15］。对于m iR-29c却没有人设想过能够调控APP蛋白的表达。我们使用了 miRNA靶基因预测数据m iRBase、m iRanda、PicTar和 TargetScan四种数据库综合，但除m iRBase外，所有常用的m iRNA预测数据库没有预测出m iR-29c可以负向调控APP。我们采用了miRNA芯片检测3、6月龄APP/PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型大脑中miRNA表达情况，并通过实时定量PCR证实miR-29c在3月、6月、9月龄小鼠中表达明显升高。结合m iRBase的预测，我们在稳定表达m iR-29c的SH-SY5Y细胞系中通过Western blot检测发现APP蛋白的表达减少。共转染m iR-29c表达载体及 APP表达载体到 HEK-293T细胞，Western blot检测APP蛋白明显减少，在HEK-293T细胞中通过双荧光素酶检测系统检测，没有发现转染miR-29c细胞的荧光素酶表达明显减少。通过对实验结果初步分析我们认为可能m iR-29c对 APP mRNA的调控位点可能不在 APP3’UTR。根据文献报道，m iRNA对靶基因的调控位点也可能位于开放阅读框（open reading frames，ORF）及植物5’UTR内［16-17］。m iR-29c对 APPmRNA具体的调控位点仍需要进一步实验探索。

在 APPSWE/PS1ΔE9双转基因小鼠体内miR29c表达增高，我们分析认为可能是一种自身保护机制。APPSWE/PS1ΔE9双转基因小鼠是一种能够产生大量 APP蛋白及老年斑的转基因小鼠［18］，而m iR-29c的表达升高可能是为了对抗 APP蛋白升高，是小鼠体内的一种保护性反馈抑制，以减少体内APP代谢途径中Aβ蛋白最终生成。这可能与之前发现的阿尔茨海默病人中 miR-106b等微小RNA的作用等不同，阿尔茨海默病人中 m iR-106b减少促进了阿尔茨海默病人大脑中产生APP。

本课题通过在体外水平证实了miR-29c对靶基因APP表达的存在负向调控作用，为阿尔茨海默病的治疗提供了新的思路。

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