建立H5N1流感病毒感染雪貂动物模型

鲍琳琳，占玲俊，邓 巍，许黎黎，朱 华，吕 琦，李枫棣，秦 川

（中国医学科学院实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021）

H5N1病毒从鸟直接传到人的首次病例是於1997年在香港发现。迄今，绝大多数的人类感染病例都直接来自鸟，只有个别的病例被认为是来自被感染的人，不过H5N1病毒尚未能在人与人之间建立持续的传播链。根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。由H5N1血清型引起的禽流感称高致病性禽流感，发病率和死亡率都很高，危害巨大。高致病性禽流感病毒可以直接感染人类。1997年，在我国的香港地区，高致病性禽流感病毒H5N1型导致了18人感染，6人死亡，首次证实高致病性禽流感可以危及人的生命。

本研究选用人源 H5N1亚型禽流感病毒 A/ Vietnam/1203/2004对雪貂进行人工感染试验，以期建立人源流感病毒感染雪貂模型［4-8］，为探索禽流感病毒的病原特性、致病机制、药物筛选及其疫苗评价提供研究平台。同时，为进一步防控禽流感在人间的暴发流行提供必要的实验参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 H5N1病毒株：A/Vietnam/1203/2004（V），其HA效价都为1∶256，108TCID50/m L，由香港大学陈鸿霖教授惠赠。

1.1.2 动物：由美国引进去势雪貂（Mustela Pulourius Furo）6只，4～10月龄，500～1200 g。实验前进行血清学检查，HI方法检测 H1N1，H5N1抗体，抗体阴性为合格雪貂方可入组实验。

1.1.3 试剂：RNA提取试剂盒 RNeasy Mini Kit购自QIAGEN公司，逆转录试剂盒SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System购自Invitrogen公司，荧光染料Power SYBR Green PCR Master Mix，48孔0.2 mL PCR反应管 Fast Optical 48-well RXN Plate，及光学反应盖膜48-Well Optical Adhesive Film 25PK均购自ABI公司，实时荧光定量 PCR仪为 ABI公司StepOne系列产品。

1.2 方法

1.2.1 雪貂的感染性

实验在本所的BSL-2实验室中进行。将6只雪貂随机分为2个组，每个滴度3只，每笼一只。将雪貂采用兽用氯胺酮轻度麻醉，将流感 A/Vietnam/ 1203/2004病毒株分别以103TCID50和104TCID50滴鼻感染，每只雪貂鼻孔内均匀滴入500 uL病毒液。独立送风隔离笼具中正常饲养。实验的观察期为5 d。

1.2.2 皮下芯片植入

实验开始前2周，雪貂采用兽用氯胺酮轻度麻醉后，皮下植入芯片，通过芯片录入实验动物编号，每日读取动物体温数值。

1.2.3 临床观察和取样

实验开始前1周每日记录雪貂体温及体重变化作为感染前背景资料。感染后每天记录体温、体重变化、观察并记录有无咳嗽、流涕、呕吐、腹泻、气促、呼吸困难、明显食欲缺乏等临床表现。感染前0 d，感染后第1～5天取鼻甲骨活检物测定病毒载量和病毒滴度。感染后第5天安乐处死动物，取动物气管、肺、心、肝、脾、肾、小肠、脑组织测定病毒病毒滴度，做病理检查。

1.2.4 病毒滴度的测定

雪貂取肺组织、肠组织放入1 m L DMEM（青霉素、链霉素各1000 IU/m L）液中，用匀浆器将组织研磨成乳剂，3000 r/min离心10 min，取上清。组织上清液10×连续稀释至10-8，接种于单层培养MDCK细胞的96孔细胞培养板上，每个稀释度接种4个重复孔，CO2培养箱中35℃静止培养，观察记录各孔细胞病变（CPE）情况，连续观察3 d，用1％火鸡血球复检，出现凝集反应的结果为阳性。按照 Reed-Muench方法计算感染雪貂脏器病毒的TCID50。

1.2.5 病理学检查

大体观察，处死动物后，详细观察气管、肺、心、肝、脾、肾、小肠、脑组织的形态变化；病理切片制备，取处死动物的肺等组织，10％甲醛固定，石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE方法染色，镜检观察。

1.2.6 PCR检测

鼻甲骨活检物可以直接应用试剂盒RNeasy kit （Qiagen）提取 RNA。鼻甲骨活检物溶于 1 m L DMEM培养基中，RNA最终浓度溶入无RNA酶的水中。总RNA中取8μL RNA应用SuperScriptⅢReverse Transcriptase（Invitrogen）逆 转 录。取cDNA2μL应用Power SYBR Green PCR Master Mix （ABI）作 定 量PCR。引 物：NP688Fwd5’-ttccaaacagcagcacaaag-3’ ， NP817Rvs25’-tatgggc caatgatcctctc-3’。程序：①94℃ for 3 m in；②94℃ for 30 s，③61℃ for 30 s，④72℃ for 30 s（②-④运行35个循环），⑤95℃，15 s；⑥60℃，1 m in；此后运行溶解曲线程序，95℃，15 s，60℃，1 min；95℃，15 s。荧光定量PCR仪可直接读取病毒载量结果。

2 结果

2.1 雪貂感染后体重变化

雪貂感染后出现体重下降，103TCID50组和104TCID50组由感染后第1天一直持续到实验结束，104TCID50组在感染后体重下降最高达20％以上，体重变化见表1。雪貂感染后体重变化率见图1。

图1 雪貂感染后体重变化率（％）Fig.1 Body weight change of ferrets（％）体重变化率％=（当天体重-0天体重）/0天体重*100％Weight change rate％=（the day weight-0 day weight）/0 day weight*100％

2.2 雪貂感染后体温变化

雪貂感染后出现体温升高，与感染前比较体温最高上升2℃。103TCID50和104TCID50组雪貂在感染后第2天出现体温升高，一直持续到实验结束（感染后第5天），体温变化见图2。

图2 雪貂感染后体温变化（℃） Fig.2 Body temperature change（℃）

2.3 雪貂感染后临床表现

雪貂感染然后表现为

临床评分标准：NIH提供的雪貂感染实验观察指标分为鼻部症状和活动度两个部分，具体指标见表1。

表1 雪貂感染后临床评分标准Tab.1 Criteria for clinical sign score

雪貂感染后出现以活动度下降为主临床改变，即表现为不活跃、对外界刺激的反应性下降，上呼吸道感染的症状如：打喷嚏、流鼻涕、呼吸困难的症状几乎观察不到。具体到2个剂量组的反应可以看到104TCID50组症状要明显较103TCID50组严重，也主要是以活动度下降为表现的改变。其中103TCID50组雪貂感染后第4天2#死亡，104TCID50组雪貂感染后第5天6#死亡，特别值得注意的是感染雪貂死亡前临床没有出现突然地体温升高、呼吸急促、呼吸困难等症状。雪貂感染后临床变化情况见图3。

图3 雪貂感染后临床表现评分Fig.3 Score of clinical sign

2.4 感染雪貂病理变化结果

雪貂感染H5N1病毒第5天后肺组织大体呈现多个肺叶腹侧面和背侧面出现片状灶状的坏死灶和出血灶，其他组织大体观察未发现明显异常。镜下观察发现肺组织呈炎性充血、出血、水肿、坏死、渗出的重度肺炎病理改变。大脑组织可见局灶性脑炎，血管周围炎细胞呈“套袖”装浸润，可见小灶状坏死。免疫组化染色可以观察到，尽管小肠组织没有观察到病变，在肺组织、脑组织、小肠组织均可以看到被病毒感染的阳性细胞，见彩插5图4。

表2 雪貂感染后鼻甲骨活检物病毒培养滴度情况（单位：log10 TCID50） Tab.2 Virus detection and titration in samples from nasal cavity（log10 TCID50）

表3 雪貂感染后组织病毒培养滴度情况（单位：log10 TCID50）Tab.3 Virus culture from tissues of ferrets（log10 TCID50）

2.5 感染雪貂病毒的复制及释放

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活检物做病毒滴度测定，结果显示103TCID50组雪貂在感染后第2～3天检测到病毒，病毒滴度为102.3～103.8TCID50。104TCID50组雪貂在感染后第1～5天都检测到病毒，病毒滴度为 102.3～103.8TCID50。病毒分离结果显示雪貂在感染后上呼吸道排毒是呈现随感染的天数逐渐上升的趋势，即表示病毒在上呼吸道不断复制排出。这与温和的季流病毒比较有明显的不同，H3N2病毒株感染后通常会出现上呼吸道的病毒排出随天数增加而下降，H5N1作为高致病流感病毒株致死率高可能与这个结果有一定的关系。鼻甲骨活检物病毒滴度结果见表2。

雪貂在感染后第5天安乐处死，取雪貂气管、肺、心、肝、脾、肾、小肠、脑组织做病毒滴度测定。结果显示各个组织都能够分离到病毒，其中以气管和肺组织的病毒滴度最高，103TCID50组雪貂病毒分离的阳性率为5/24，104TCID50组雪貂病毒分离的阳性率为13/24。以上的结果反映了H5N1病毒感染雪貂，呼吸系统的器官是病毒侵袭的重要对象，呼吸系统以外的器官也会受到病毒的攻击，并且病毒可以突破血脑屏障感染脑组织，这就解释了为什么感染禽流感病毒病人会出现多系统多器官受损和出现神经系统的症状。各组织脏器病毒滴度结果见表3。

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活检物做病毒载量测定，结果显示103TCID50组和104TCID50组雪貂在感染后第1天至感染后第5天，病毒载量呈现曲线上升的趋势，这与病毒分离的结果是相一致的，结果见图5。

3 讨论

图5 雪貂鼻中病毒载量变化Fig.5 Virus loading on nose of ferrets infected

H5N1型高致病情流感传播途径主要有两种，通过水禽或其污染物直接传到人或通过中间宿主（如：猪）传到人。人感染高致病性禽流感后，起病很急，早期表现类似普通型流感。主要表现为发热，体温大多在39℃以上，持续1～7 d，一般为3～4 d，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、头痛、全身不适，部分患者可有恶心、腹痛、腹泻、稀水样便等消化道症状，极少数会出现神经系统症状。高致病禽流感感染死亡率超过60％。

实验结果显示，A/Vietnam/1203/2004人源H5N1型禽流感病毒可以感染雪貂，应用的病毒滴度死亡率为33％。感染后在雪貂除气管和肺组织还可在心、肝、脾、肾、小肠、脑组织中分离到病毒。说明该病毒能够侵染雪貂的肺、脑、肝、肾等多种器官并造成神经系统感染，这与感染人的H5N1禽流感病毒毒株具有共同的特性［9-10］。雪貂鼻甲骨活检物病毒分离结果显示病毒在感染后第2天至第5天呈现上升的趋势，病毒载量的结果与此结果相一致，这与温和型的季节性流感H3N2在雪貂上的表现不一致（病毒释放呈逐天下降的趋势）［2］。这可能也是雪貂感染后持续体温升高，体重严重下降，活动度下降的原因之一。雪貂的临床症状出现的早晚和严重程度与接毒量有关，接毒量大的雪貂体重下降快，症状出现早，体重下降多；随接毒量减少症状出现渐晚，症状减轻。因此，有理由推断，即使H5N1型禽流感在人间大流行，因个体差异和接触病毒量的差别，其致病性也会有所差异。感染后雪貂解剖发现肺组织呈炎性充血、出血、水肿、坏死、渗出的重度肺炎病理改变，脑组织的组化染色中可以观察到被病毒感染的阳性细胞。

雪貂对该H5N1型禽流感病毒呈现出规律的与人类感染流感病毒相似的以肺炎为主的临床症状、典型的病理变化和高致死率，是良好的H5N1相关研究的动物模型。

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