转录因子E2F-1与垂体肿瘤转化基因（PTTG）在大鼠PRL瘤中的表达

程海梅，徐 春，杨雪梅，刘晓军

（1.武警总医院内分泌科，北京 100039；2.武警总医院药剂科，北京 100039）

催乳素瘤（PRL瘤）是最常见的功能性垂体腺瘤，可引起闭经、泌乳、不孕（育）、高泌乳素血症等内分泌紊乱，垂体增大可压迫邻近组织出现视力减退、视野缺损、颅内高压等表现，因其生长隐匿常不能早期发现，严重危害人类健康。PRL瘤主要是单克隆细胞起源，对于其确切的发病机制，目前还不是很统一。垂体肿瘤转化基因（PTTG）是第一个在大多数垂体腺瘤中表达的肿瘤转化基因，PTTG过度表达促进垂体腺瘤形成的机制目前仍无圆满的解释。细胞周期调节失控导致细胞增殖是肿瘤发生的重要原因，腺病毒E2启动子结合因子1（E2F-1）是调控细胞周期的关键因子之一，其通过调控一系列靶基因的表达来促进细胞周期的进程。有研究发现，PTTG启动子上存在 E2F-1的特异结合序列，PTTG的高表达是否与 E2F-1有关，E2F-1在PRL瘤形成过程中究竟起到什么作用，本研究采用免疫组化方法检测转录因子E2F-1蛋白质和PTTG蛋白质在雌激素诱发的大鼠PRL瘤中的表达情况，探讨两者在PRL瘤发生发展中的作用及两者之间是否有关。定后，常规脱水，石蜡包埋，切片厚约3 um，苏木素-伊红染色，封片进行显微镜观察。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂

成年雄性W istar大鼠（体重120～150 g，由军事医学科学院实验动物中心提供，编号：SCXK（军） 2007-004）；17β-雌二醇（由 Sigma公司提供）；血清催乳素检测试剂盒（购自福建迈新生物技术开发公司）；兔抗鼠PTTG多克隆抗体（工作浓度1∶200～500），兔抗鼠E2F-1多克隆抗体（工作浓度1∶200～500），浓缩型DAB显色液以及 SP染色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠 PRL瘤模型的制备：40只成年大鼠（120～150 g）随机分为2组：正常对照组（C组，n= 20只）皮下植入空白硅胶管；PRL瘤组（P组，n=20只）皮下植入含有17β-雌二醇（约20 mg）的硅胶管；用药10周后，用水合氯醛麻醉大鼠，心脏穿刺取血，4％多聚甲醛心脏灌流体内固定，取出垂体，称重后放于4％多聚甲醛内固定。

1.2.2 垂体组织的病理学观察：标本经多聚甲醛固

用药10周后，实验组大鼠与对照组比较，平均体重明显降低（P＜0.01）；垂体重量明显增加（P＜0.01）；血清PRL水平明显升高（P＜0.01）（表1）。

1.2.3 ELISA法测定血清 PRL水平：心脏穿刺取血1 m L，室温自然凝固，离心（3000 rpm，15 min）后取血清，放入 -70℃冰箱保存。待标本收集完用ELASA测定大鼠血清催乳素水平。

1.2.4 免疫组化SP法检测PTTG蛋白质、E2F-1蛋白质的表达：垂体经4％多聚甲醛固定、石蜡包埋、3μm连续切片。免疫组化染色操作步骤按说明书进行。采用已知阳性片为阳性对照，PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

PTTG蛋白质和E2F-1蛋白质阳性表达均为胞浆和胞核内棕黄色颗粒。本实验结果判定标准参照Fromowitz［1］综合计分法：随机选择5个高倍镜视野（200×），按阳性细胞所占比例及细胞染色强度进行分级：阳性细胞数 ＜5％为0分，6～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；染色强度评分：无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；两项积分相加：0～1分为阴性，≥2分为阳性。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，大鼠体重、垂体重量、PRL瘤以X±S表示，两组间差异用t检验，免疫组化结果分析采用卡方检验，相关性分析应用Spearman相关性检验，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 两组大鼠体重、垂体重量、血清 PRL水平的比较

2.2 两组大鼠垂体组织病理学的比较

HE染色下，对照组垂体细胞排列规则，呈圆形，胞浆少，胞核大小一致，以嗜酸性粒细胞为主（封2图1）。实验组细胞排列紊乱，细胞数目明显增加，细胞呈圆形或多角形，胞体增大，胞浆带增宽，细胞分化差，核大小不一致，可见大核细胞，细胞增生明显，以嗜酸性粒细胞为主（封2图2）。

表1 两组大鼠体重、垂体重量、血清PRL水平比较Tab.1 Comparation of body weight，pituitary weight，serum PRL levels

表2 两组大鼠垂体中PTTG蛋白质、E2F-1蛋白质表达情况Tab.2 Comparation of PTTG、E2F-1 protein expression between the two groups

2.3 PTTG蛋白质在两组大鼠垂体的表达

PTTG蛋白质在实验组呈高表达70％（14/20），阳性颗粒主要出现在胞浆，部分位于细胞核，呈棕黄色或黄褐色颗粒（封2图4），显著高于对照组10％（2/20），对照组着色细胞数目少，细胞染色浅，与背景颜色难以区分（封2图3），两组差别具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.4 E2F-1蛋白质在两组大鼠垂体的表达

E2F-1蛋白质在实验组呈高表达 80％（16/ 20），阳性颗粒胞浆和胞核中弥漫分布，染色较深（封2图6），显著高于对照组20％（4/20），且对照组阳性颗粒主要位于胞浆，染色较浅（封2图5），两组差别具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.5 PTTG蛋白质和E2F-1蛋白质在大鼠PRL瘤中表达的相关性

PRL瘤组14例 PTTG蛋白质阳性的标本中E2F-1蛋白阳性者13例，阴性1例；6例 PTTG蛋白阴性的标本中E2F-1蛋白质阳性者3例，阴性3例，两者表达一致率为70％，统计学分析PTTG表达与E2F-1表达呈显著正相关（γ=0.764，P＜0.051）。

3 讨论

雌激素是垂体催乳素（PRL）细胞增生和 PRL基因表达的强有力的刺激因子，雌激素长期作用引起垂体 PRL细胞增生、PRL分泌增加，最终形成PRL瘤。由于垂体的特殊性，正常垂体难以获得，建立稳定、可靠的大鼠垂体腺瘤模型对研究腺瘤的发病机制和寻找有效的治疗措施具有重要意义。有研究显示，长期给予大鼠雌激素，可诱发大鼠PRL瘤。大鼠垂体腺瘤动物模型的成功与否可以从三个方面进行判断：（1）一般认为大鼠垂体重量超过50 mg即可判断为腺瘤［5］，也有观点认为大于30 mg即可判定建模成功［6］；（2）血浆PRL浓度显著增高； （3）组织病理学检查。本实验选用 W istar大鼠，用皮下植入含有雌激素的硅胶管，结合上述指标分析，10周后垂体瘤模型成功率达100％。

垂体肿瘤转化基因（pituitary tumor transforming gene，PTTG）是Pei［4］等用mRNA差异显示技术从大鼠垂体瘤细胞中分离出的新型原癌基因，体外研究它能诱导NIH3T3成纤维细胞的转化，在体内能诱发裸鼠实体肿瘤的形成，是一种强有力的肿瘤转化基因。PTTG通过促进细胞转化、诱导血管形成、抑制姊妹染色单体分离、反式激活c-myc等癌基因的途径参与肿瘤的形成。肿瘤细胞中PTTG cDNA的序列分析未发现突变，PTTGmRNA表达水平却明显升高，说明其致癌作用主要依赖于其表达水平的高低［5］。Donangelo［6］等发现，PTTG失活的小鼠表现出垂体增生不良，而PTTG过表达导致垂体局灶性增生说明PTTG含量与垂体增生和肿瘤的形成直接相关。本实验研究发现，大鼠PRL瘤中PTTG蛋白质表达明显增高，正常垂体组织中无明显表达，说明PTTG在PRL瘤的发生发展过程中起重要作用。

E2F-1作为转录因子家族的一员，对于调节细胞由G1期进入S期起着至关重要的作用。在G0和G1早期，E2F-1与低磷酸化的 pRb结合，E2F-1转录活性受抑制；G1中后期，pRb被cyclin D/cdk4/ 6和 cyclin E/cdk2磷酸化后，E2F-1与 Rb分离，E2F-1被游离后与其靶基因结合，激活它们的转录［7］。

很多参与DNA复制和细胞周期调控的基因启动子区存在E2F-1 DNA结合位点，E2F-1与其结合后，促使细胞由G1期进入S期，继而推动细胞周期进程，导致细胞增殖和肿瘤的形成。迄今为止发现，E2F-1可以参与 1000多种基因的调控［8］。Zhou［9］等发现，PTTG启动子上也存在 E2F-1的特异结合序列，E2F-1与 PTTG启动子结合后，激活PTTG的转录。研究还发现，E2F-1和 PTTG在 Rb +/-鼠垂体组织和人垂体肿瘤中成一致高表达。体外 H1299细胞转染表达 E2F-1的质粒后，PTTGmRNA表达水平明显升高；将Rb siRNA转染H1299细胞后，Rb被抑制，E2F-1表达水平升高，同时PTTG表达量也明显上调，这些提示PTTG的表达可能受E2F-1的调控。本实验研究发现，PTTG蛋白质和E2F-1蛋白质在雌激素诱导的大鼠PRL瘤中呈一致高表达，进一步证实了两者之间的关系。

Yamasaki［10］等研究则发现，E2F-1缺失的 Rb1 （+/-）小鼠垂体肿瘤的发生率减少，提示 E2F-1可能在垂体腺瘤的发生中起到一定作用。本实验发现：E2F-1蛋白在大鼠PRL瘤中的表达明显高于正常垂体组织，并且E2F-1蛋白质与PTTG蛋白质表达呈明显正相关，说明E2F-1在PRL瘤的发生发展中起着促进作用，作者推测可能是通过调控PTTG的表达来实现。

基于E2F-1在肿瘤中的异常表达及其对细胞周期和细胞凋亡的调控，出现了很多针对E2F-1作为靶点设计的肿瘤基因治疗试验，并取得了初步成效［11-13］。明确了E2F-1在垂体肿瘤形成过程中的作用，有利于从分子水平开展对垂体肿瘤基因治疗的研究。

综上，用皮下植入雌激素的方法能成功诱导Wistar大鼠PRL瘤的发生，PTTG蛋白质与E2F-1蛋白质在雌激素诱发的大鼠PRL瘤中呈一致高表达，两者共同参与了大鼠PRL瘤的发生发展，这对以后垂体肿瘤的治疗提供了更多的契机。

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