H5N1禽流感病毒实验室检测方法灵敏性比较

战大伟，李 靖，刘伯华，颜克松，户 义，姜 涛，祝庆余

（1.解放军总医院第一附属医院，北京 100037；2.军事医学科学院微生物流行病研究所，北京 100071）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）属正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒属A型流感病毒，是分节段的负链单股RNA病毒。高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza virus，HPAIV）是由以H5N1、H7N7为代表的H5和H7两个亚型引发的疾病，对养禽业危害巨大，而且影响禽类产品的安全［1，2］。1997年香港首次发生H5N1禽流感病毒跨越种属屏障感染人类并致死的事件，至今在全球范围内，高致病性H5N1亚型禽流感频繁发生并造成人类感染，具有很高的致死率［3，4］，H5N1亚型禽流感作为人畜共患病的公共卫生地位更加突出［5-7］。

H5N1禽流感病原学检测的临床与预防意义是早期诊断、确诊，及时识别传染源，尽早隔离与控制，因此应用灵敏、特异和快速的检测方法就显得尤为重要。对于送检的样本及病料，目前实验室常用检测方法主要有传统的细胞接种观察 CPE法（cytopathic effect）、血凝实验 （hemagglutination，HA）以及分子生物学 RT-PCR、Real-time RT-PCR等［8-12］。本研究应用 A/Beijing/01/03 H5N1病毒，鸡胚扩增，蚀斑（plaque form ing unit，PFU）技术定量病毒滴度，应用以上4种常用方法检测稀释的病毒悬液，比较检测的最低稀释度，比对检测方法的灵敏性等特点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 病毒与细胞

A/BeiJing/01/03为实验室分离保存的高致病性H5N1禽流感毒株［13］；MDCK细胞株为本所细胞库保存。实验中具有感染性病毒粒子的操作均在在本所BSL-3实验室内进行。

1.1.2 试剂

RNA提取应用 Rneasy Mini Kit，购自 QIAGEN公司；RT-PCR应用 One-Step RT-PCR Kit，购自QIAGEN公司；Real-time RT-PCR应用One-Step RTPCR Master M ix，购自 ABI公司；低溶点琼脂糖，购自Invitrogen公司；鸡血红细胞及9日龄SPF鸡胚，购自维通利华公司。

1.1.3 引物

RT-PCR及Real-time RT-PCR检测H5N1病毒的HA基因保守区域［14］。RT-PCR检测引物：上游引物：5’-CTCCCCTGCTCATTGCTATG-3’，下游引物：5’-GCCATTCCACAACATCCACCC-3’，扩增片断长度为219 bp，引物由北京三博远志生物技术公司合成。Real-time PCR检测引物：上游引物：5’-ACATGCCCAAGACATACTGGAA-3’，下游引物：5’-GAATTCGTCACACATTGGGTTTC-3’，探针：FAMCACACAACGGGAAGCTCTGCGATCT-TAMRA，扩增片段长度为130 bp，探针5’端标记的荧光报告基团是 FAM，3’端标记荧光淬灭基团 Non-fluorescent quencher和minor groove binder（MGB），由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖：将 H5N1病毒应用 2％FBS DMEM 1∶100倍稀释，经绒毛尿囊腔接种法感染9日龄SPF鸡胚，200μL/枚，石蜡溶化封口，37℃温箱培养。每日照检鸡胚一次。挑出死亡鸡胚，放置4℃冰箱过夜后收获鸡胚尿囊液，1000 r/min离心5 m in，上清分装在细胞冻存管中，-70℃冻存备用。

1.2.2 病毒 PFU定量：采用双层琼脂糖法：应用2％FBS DMEM维持液将病毒液10倍依次稀释，每梯度吸取0.8 m L病毒液进行病毒蚀斑定量。应用生长良好MDCK细胞（2×106个/mL）铺6孔板，过夜培养。吸弃10％FBS DMEM培养液，换为 earle液，浸泡1 h后吸弃。将病毒稀释液加入6孔板中，吸附1 h，加入第一层0.5％乳白蛋白水解物-犊牛血清营养低溶点琼脂糖，1 m L/孔，待琼脂糖充分凝固后放入37℃、5％CO2培养箱中。48 h后加入含0.1％中性红的第二层琼脂糖染色，1 m L/孔，过夜培养，蚀斑观察计数。

1.2.3 RNA提取：病毒核酸提取应用 QIAGEN公司Rneasy Mini Kit，按试剂盒操作说明书进行。

1.2.4 病毒血凝实验：向96孔血凝板各孔中加生理盐水 0.25 m L，吸取0.25 m L病毒，加入第一孔中，与生理盐水充分稀释后吸0.25 m L加入第二孔中，依次2倍稀释。每孔中加入1％鸡红细胞悬液0.25 m L，将血凝板放入湿盒中，室温放置45 m in，观察记录实验结果。

1.2.5 细胞接种：应用生长良好的 MDCK细胞铺96孔板，过夜培养。吸弃 10％FBS DMEM，根据PFU计数，首先用2％FBS DMEM稀释病毒为10整数倍，然后10倍倍比稀释的病毒液，每个梯度接种4孔，100 m L/孔，37℃、5％CO2培养箱中培养，逐日显微镜下观察记录细胞病变。

1.2.6 RT-PCR：50μL反应体系：10μL 5×RTPCR缓冲液，2μL dNTP m ix，10μL 5×Q溶液，6 μL 5μmol/L上游引物，6μL 5μmol/L下游引物，2 μL酶混合液，0.5μL 20U/μl RNase抑制剂，9μL H2O，5μL模板 RNA。PCR参数：反转录50℃ 30 m in，起始 PCR反应95℃ 15 min，三步循环：变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循环数40；延伸72℃2 min。PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，80 V，40 min，凝胶成像。

1.2.7 Real-time RT-PCR：25μL反应体系：5μL RNA，15μL 2×Taqman one-step RT-PCR混合液，0.75μL RNase抑制剂，终浓度为0.25μmol/L的上游引物、下游引物及终浓度为0.125μmol/L探针。反应参数：逆转录48℃ 30 m in，起始反应95℃ 10 m in，预变性，95℃ 15 s，60℃ 1 m in扩增40个循环。在60℃进行单点荧光检测。

2 结果

2.1 待检病毒定量

收获得到含有大量感染性H5N1病毒粒子的鸡胚尿囊液。A/BeiJing/01/03 H5N1病毒稀释液在六孔板形成清晰的白色、大小不均一的混合病毒蚀斑，病毒滴度为2.25×107PFU/m L（彩插2图1）。

2.2 灵敏性实验结果

2.2.1 CPE观察：高浓度病毒接种的MDCK细胞自48 h在显微镜能观察到明显病变，细胞发生融合，后期细胞变圆、崩解。至第5天，10-6病毒稀释液接种的MDCK细胞病毒死亡，107稀释的病毒接种细胞及对照细胞生长良好（彩插2图2）。细胞接种方法检出灵敏度至10 PFU/m L。

2.2.2 血凝实验：2-1～2-6血凝结果为“4+”，2-7血凝结果为“3+”。鸡血红细胞血凝实验能够检出2-7病毒稀释液，检出灵敏度至3.52×105PFU/m L （彩插2图3）。

2.2.3 RT-PCR检测结果：10-1～10-4病毒稀释样本能够清晰检出特异性219 bp条带，检出灵敏度至103PFU/m L（图4）。

图4 RT-PCR检测结果Fig.4 The Results of detection with one step RT-PCR

2.2.4 Real-time RT-PCR检测结果：根据实验室对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件的标准选择与优化，10-4，10-5为阳性，10-6为弱阳性结果，所以该方法能够检出10-6病毒稀释液，检出灵敏度至10 PFU/m L（图5）。

3 讨论

几种检测方法灵敏度比较：细胞接种与 Realtime RT-PCR病毒检测灵敏度最高，能够检出 10 PFU/m L病毒粒子；RT-PCR能够检出103PFU/m L病毒粒子，检测灵敏度比细胞CPE及Real-time RTPCR低 100倍；血凝实验灵敏度最低，仅能检出3.52×105PFU/m L病毒粒子。对于病毒含量较低的待检样本，细胞接种与Real-time RT-PCR是首选的检测方法。

图5 Real-time RT-PCR检测结果Fig.5 The Results of detection with Real-time RT-PCR

几种检测方法检测用时比较：细胞接种方法用时最长，高浓度病毒接种的敏感MDCK细胞也需要2 d才能够观察到显著病变，低浓度病毒接种的细胞需要5 d出现病变，实验前期细胞培养、材料处理等工作也需要一定时间；血凝实验费时最短，能够在2～3 h完成检测；RT-PCR及 Real-time RT-PCR需要样本处理、RNA提取等前期工作，但能够在6～7 h得到结果。

不同的送检样本、采集方法、送检条件及方式影响感染性H5N1病毒的存活，从而会直接细胞接种方法的检出灵敏度。此外，传统的细胞接种实验及血凝实验条件要求高，只能在BSL-3实验室内进行，实验结果也需要尚需要如电镜观察或分子生物学方法进一步验证。但是细胞接种检测方法能够同时分离获得病原体，有利于病原学的进一步研究。

RT-PCR及Real-time RT-PCR等分子生物学方法应用世界卫生组织推荐的针对H5亚型HA基因保守序列检测引物，实验证明均具有高保真性［14］，用于检测病毒核酸，对病原体要求低，只要有达到检测下限的未降解AIV核酸即可，具有特异性，高度灵敏性，又检测快速，而且简便易操作，不需要高级别生物安全实验室条件等保障条件，所以更适合于H5亚型禽流感病毒的快速诊断，因而分子生物学方法在H5N1禽流感的检测中得以广泛的应用。RT-PCR产物能够进行扩增片段的序列测定及序列比对分析，为流行病学调查研究提供重要数据。Real-time RT-PCR检测技术，闭管式操作能够最大程度避免污染与假阳性结果的出现，还可以实现实时定量，适合用于病原体的早期快速诊断［15-17］。

综上所述，将传统的检测手段与分子生物学方法结合，检测中相互印证，能够准确、快速完成H5N1禽流感病原学检测工作，为禽流感的快速诊断和分子流行病学调查提供技术支持。

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