噪声影响下纯音诱发听性脑干反应的改变

吴学文 丁大连, 蒋海燕 刘洪 Ed Lobarinas 孙虹 Richard Salvi

·基础研究·

噪声影响下纯音诱发听性脑干反应的改变

吴学文1,2丁大连1,2,3蒋海燕2刘洪1,2Ed Lobarinas2孙虹3Richard Salvi2

目的观察噪声影响下纯音诱发听性脑干反应(ABR)的改变。方法将10只成年南美栗鼠随机平均分为两组，分别暴露强度为105 dB SPL窄带噪声，中心频率4 kHz，2 h或5 h。噪声暴露前、后1 h、2周及4周，测试动物对短纯音声音刺激(1、2、4、8、12以及16 kHz)诱发的听神经复合动作电位(CAP)和ABR，并结合耳蜗毛细胞的损害程度和范围进行分析。结果2 h和5 h的窄带噪声暴露造成南美栗鼠不同程度和范围的耳蜗毛细胞损害。与毛细胞损害部位相对应频率的CAP及ABR阈值在暴露噪声后均出现不同程度的提高。噪声暴露后4周，尽管某些动物的CAP已经发生了不可逆性永久阈移，但在某些短纯音频率诱发的ABR阈值却呈现部分恢复，甚至在个别动物的CAP测试波形中引出了低于CAP阈值的ABR波形成分。结论中枢听觉功能的重组在一定条件下可能促进脑干听觉神经元提高感知因周边耳蜗损害而引起微弱听觉输入信号的敏感性。(中国眼耳鼻喉科杂志，2011，11：72-76)

窄带噪声；听性脑干反应；复合动作电位；中枢听觉重组；南美栗鼠

噪声暴露后即刻引起的可逆性听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)及复合动作电位(compound action potential,CAP)阈值升高被称为暂时性阈移 (temporary threshold shift,TTS)，原因主要是噪声刺激引起内毛细胞从静纤毛、细胞体到底部的毛细胞I型传入听神经末梢突触的可逆性损害，但是未发生耳蜗毛细胞纤毛倒伏、细胞死亡和丢失等永久性病变，ABR和CAP在受损部位自我修复后可完全恢复。然而如果噪声刺激形成耳蜗毛细胞不可逆性破坏，则使听觉反应阈发生永久性阈移 (permanent threshold shift,PTS)[1-5]。下丘和耳蜗核神经元近电场记录的实验结果表明，在噪声暴露引起PTS后，中枢听觉神经元可逐渐产生代偿性反应增强[6-11]。然而，中枢听觉通路神经元的这种“增益”效应是否会影响PTS耳聋动物的ABR测试结果，尚无肯定答案。鉴于ABR测试是临床客观评估听觉水平的重要检测指标之一，本实验观察和比较南美栗鼠窄带噪声暴露后的ABR和CAP变化，以探讨听觉中枢的功能重组是否对ABR的测试结果也会产生一定影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 10只购自美国瑞尔森南美栗鼠饲养场(Ryerson Chinchilla Ranch)的成年健康南美栗鼠，雌雄不拘，体质量为560～720 g。受试动物在暴露噪声前，在电耳镜下检查外耳道及鼓膜标志，以排除外耳道耵聍栓塞或中耳炎的存在，并检测所有动物的右耳耳声发射畸变产物(distortion product otoacoustic emission， DPOAE)，以确保每只动物的右耳外毛细胞功能在暴露噪声前完全正常。

1.2 左耳耳蜗毁损术和右耳圆窗龛银球电极安放 所有受试动物的左耳在噪声暴露前1周施行耳蜗损毁手术，以确保每只南美栗鼠的CAP和ABR都只能唯一来源于右侧耳蜗。每只动物的右耳圆窗龛则在噪声暴露前1周预先安放银球电极，以记录暴露噪声前后的CAP变化，同时常规检测每只动物右耳的ABR。左侧耳蜗手术破坏及右侧圆窗龛电极安放的方法简介如下：先用异氟醚麻醉动物，再用头部固定架将南美栗鼠俯卧固定在手术台的保温垫上，维持体温37 ℃，并插入肛表检测动物的体温变化。颈后部皮肤常规备皮消毒后，切开以暴露双侧听泡，从听泡背侧打开下鼓室暴露双侧耳蜗。用尖针在左侧耳蜗鼓阶上钻孔，彻底破坏左侧耳蜗。将银球电极安放在右侧耳蜗的圆窗龛内，然后用牙托水泥封闭下鼓室骨壁上的手术开口。将银球电极的另一端从颅顶皮肤穿出以引导声音刺激诱发的CAP，最后缝合皮肤切口。动物在终止麻醉后10 min内苏醒。术后每天检查手术创口并消毒局部皮肤直至皮肤切口痊愈。

1.3 噪声暴露 中心频率在4 kHz (2 800～5 600 Hz)、强度为105 dB SPL的窄带噪声由美国TDT III系统的实时处理器(RP2.1)产生，通过功效(SAE A201，Scientific Audio Electronics 公司，美国)将噪声信号放大，并经扬声器(Vifa D25AG-05-06,Madisound Speaker Components 公司,美国)在电声屏蔽室内发放噪声刺激信号。扬声器发出的噪声强度用麦克风(2559，Lamp;D)在声级计系统824(Larson Davis 公司，美国)监测(测试系统先进行校准)。噪声暴露时，南美栗鼠安放在30 cm×30 cm×30 cm的铁笼内，扬声器悬挂在动物头顶正上方。10只南美栗鼠随机平均分成2组，在窄带噪声环境的自由声场中分别暴露2 h或5 h。

1.4 ABR及CAP测试 每只南美栗鼠在暴露噪声前、后1 h、2周及4周分别测试右耳短纯音诱发的CAP和ABR。将动物麻醉后在电声屏蔽室内采用美国TDT III系统及TDT BioSigRP软件进行ABR和CAP测试。听觉测试的参数设置与作者以往采用的测试条件相同[12]。简述如下：声刺激采用短纯音，测试频率分别为1、2、4、8、12、16 kHz。短纯音的刺激重复率为25次/s。声刺激信号经低频扬声器正对南美栗鼠的右耳鼓膜，扬声器口距离外耳道口5 cm。测试ABR时，将银针制成的记录电极插入到南美栗鼠颅顶正中皮下，参考电极插入同侧耳后皮下，接地电极插入对侧耳后皮下。测试CAP时，记录电极与预先经颅顶皮肤穿出的圆窗龛银球电极丝相连接，将参考电极与接地电极连接使之形成短路后再插入对侧耳后皮下。ABR波形的实时观察窗为10 ms，CAP波形的实时观察窗设定为20 ms。ABR的波II和CAP的波N1确定为判断动物听觉反应的依据。

1.5 动物标本处理 所有动物均在噪声暴露4周后用过量CO2麻醉后断头处死，快速取出颞骨，打开右侧听泡暴露耳蜗，将镫骨底板推入前庭池，在蜗尖钻孔并刺破圆窗膜，然后从蜗尖小孔灌入37 ℃琥珀酸脱氢酶组织化学反应液(琥珀酸脱氢酶组织化学反应液中含有2份0.1%氯化硝基四氮唑蓝溶液、1份0.2 mol/L琥珀酸钠溶液和1份pH值为7.6的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液)。将耳蜗组织块浸入琥珀酸脱氢酶组织化学反应液并在37 ℃恒温箱内孵育60 min，然后将耳蜗浸入10%甲醛溶液中固定12 h。在立体显微镜(解剖显微镜)下常规分离取出全耳蜗基底膜，并制作成全耳蜗基底膜铺片[5]。

1.6 全耳蜗毛细胞计数 在放大400倍的显微镜观察下，用长度为0.24 mm的显微测微尺对全耳蜗基底膜铺片从顶回到底回逐个视野测量基底膜的长度，并逐个视野依次进行内外毛细胞计数。计数结果输入计算机，并与耳蜗图软件中的正常南美栗鼠耳蜗毛细胞的正常密度值进行自动比较。应用耳蜗图软件常规绘制全耳蜗毛细胞图[13]。

1.7 统计学处理 由于噪声暴露2 h组的动物仅发生个别耳蜗外毛细胞散在性缺失，而噪声暴露5 h组的动物发生了不同程度耳蜗毛细胞缺失，因此根据耳蜗毛细胞的不同损失程度将10只动物重新划分为毛细胞轻度缺失组、毛细胞中度缺失组以及毛细胞重度缺失组。将暴露噪声前、后采集的ABR及CAP数据输入GraphPad prism 5软件系统，应用t检验及方差分析系统进行统计分析和差异性比较，Plt;0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 窄带噪声造成的耳蜗毛细胞缺失 经中心频率在4 kHz (2.8～5.6 kHz)、强度为105 dB SPL的窄带噪声暴露2 h或5 h后4周，南美栗鼠耳蜗毛细胞发生了不同程度的破坏，其中噪声暴露2 h的动物仅发生个别外毛细胞散在性缺失，而噪声暴露5 h的动物大多数发生了较严重的耳蜗毛细胞损害。以耳蜗毛细胞损失程度进行重新分类，10只南美栗鼠中有5只仅发生了散在性少量外毛细胞缺失，这些动物都被归类到毛细胞轻度缺失组，均来自于2 h暴露组。3只动物在特征频率(4 kHz和6 kHz)噪声基底膜上相应区域的外毛细胞缺失率达到50%，但在基底膜上对应其他频率的区域未见明显的毛细胞缺失，这3只动物被归类到毛细胞中度缺失组。另外2只南美栗鼠在4 kHz噪声能量中心对应的基底膜区域出现100%的外毛细胞损失，而且该区域的内毛细胞也遭到严重破坏。这2只动物在4 kHz和6 kHz噪声能量中心以外的基底膜高频对应区域和低频对应区域亦发生严重的外毛细胞缺失和内毛细胞破坏，其中以靠近耳蜗底回的高频感应区域中的毛细胞破坏更为严重，因此归类到毛细胞重度缺失组(附1页图1)。

2.2 噪声暴露后ABR及CAP阈值的变化 噪声暴露后1 h，每只动物的所有短纯音频率诱发的ABR及CAP阈值均发生明显升高。噪声暴露后2周和4周，毛细胞轻度缺失组动物各频率ABR及CAP均已恢复到噪声暴露前水平，其听觉诱发电位的反应阈值与噪声暴露前相比差异无统计学意义(Pgt;0.05)。 噪声暴露后4周，3只出现局部外毛细胞中度缺失的动物在4、8和12 kHz这3个频率的ABR及CAP阈值与暴露噪声前相比差异均具有统计学意义(Plt;0.05)，但其余频率短纯音诱发的ABR及CAP阈移差异无统计学意义(Pgt;0.05)。噪声暴露后4周，2只出现较大区域毛细胞重度缺失的动物在所有测试频率短纯音诱发的ABR及CAP都发生了明显阈移，与噪声暴露前相比差异均具有统计学意义(Plt;0.05)。

在噪声暴露后1 h和2周，所有动物的各频率短纯音诱发的ABR和CAP阈移程度和趋势均基本保持一致。暴露后4周，在中等程度毛细胞缺失组的南美栗鼠中，有1只动物噪声在4 kHz频率诱发的ABR阈值低于该动物的CAP阈值，其他频率未发现此现象。该动物在噪声暴露前的4 kHz短纯音诱发的ABR和CAP阈值均为30 dB SPL；噪声暴露后1 h，在4 kHz短纯音诱发的ABR及CAP阈值都上升到100 dB SPL以上；噪声暴露后2周，在4 kHz短纯音诱发的ABR和CAP阈值均下降到70 dB SPL；但在噪声暴露后4周，该动物CAP阈值仍然维持在70 dB SPL，而ABR阈值却降低到60 dB SPL，此时该动物的ABR反应阈比CAP阈值低10 dB SPL(附1页图2)。

在重度毛细胞缺失组中也发现了ABR阈值与CAP阈值变化不一致的现象。1只动物在噪声暴露前4 kHz短纯音诱发的ABR和CAP阈值分别为50 dB SPL和40 dB SPL；在噪声暴露后1 h，该动物4 kHz短纯音诱发的ABR及CAP阈值都上升到100 dB SPL以上；在噪声暴露后2周，其4 kHz短纯音诱发的ABR和CAP阈值仍在100 dB SPL以上；在噪声暴露后4周，该频率CAP阈值仍然引不出，但是ABR阈值却降到了80 dB SPL，此时该动物的ABR反应阈比CAP阈值至少低20 dB SPL以上(附1页图3)。

在毛细胞重度缺失组，另1只动物还发现了一个反常现象。在噪声暴露后4周， 当从圆窗银球电极记录这只动物4 kHz短纯音诱发的CAP时，发现该动物的CAP波形中混入了ABR的波形成分。从记录波形中可以看出，该波形中CAP阈值应该确定为90 dB SPL，而紧跟在CAP波形后面出现的ABR波形却直到60 dB SPL才消失(附2页图4)。

3 讨论

不同程度的损害性噪声暴露可引起TTS，也可导致不可恢复的PTS。噪声对听觉系统的损害机制包含多重因素，而且各种因素间相互关联和相互影响。目前对噪声性听觉损害机制比较统一的认识，包括机械性损害、血管性损害和代谢性损害3个主要方面[5]。本实验中耳蜗毛细胞轻度缺失组的南美栗鼠仅在噪声暴露后短时期内出现了TTS，其听力水平在暴露后2周(甚至可能更早)就已经完全恢复到噪声暴露前的正常听觉标准；而另外几只发生毛细胞中度或重度损害的动物却表现不同程度的PTS。在噪声引起耳聋的动物实验模型中，南美栗鼠由于总是表现耳蜗损害在频率和位置上良好的对应关系而成为较为理想的噪声性听觉损害实验动物之一。本实验采用的窄带噪声暴露在与之对应的耳蜗基底膜最大刺激部位首先造成了外毛细胞的损害，该部位存活毛细胞数量减少与其对应频率引出的CAP和ABR阈移表现良好的对应关系。即毛细胞的缺损部位和程度与相应短纯音声刺激诱发的CAP和ABR阈移程度基本吻合，而与毛细胞无损害区域相对应短纯音诱发的ABR和CAP信号则仅发生很小的阈值变化甚至不发生阈移。

听觉中枢在周边耳蜗毛细胞损失而导致听觉输入信号减弱时可发生听觉神经元的可塑性功能重组。即当听觉传入信号因毛细胞损害而明显减弱时，听觉中枢系统的神经元可以通过增加对微弱听觉信号的“感知”而变得更加灵敏。大量实验研究表明，在噪声暴露引起耳蜗毛细胞破坏之后，脑干低位听觉中枢神经元可发生相应的去抑制现象，这种中枢听觉神经元的去抑制表现为神经元反应阈值降低和神经元放电率增加以及兴奋性接收区域加宽等[6-11]。目前对中枢听觉系统可塑性改变的认识主要是依据中枢去抑制学说，根据神经元去抑制学说的有关实验证据，有理由认为由于噪声损伤减少了耳蜗对某些频率的兴奋性输入，从而引起与损伤区和其边界区对应的中枢听觉神经元产生侧向抑制减弱，因此表现出的活跃化中枢神经元都具有明显的神经元去抑制特征，这正是在耳蜗周边传入信息减弱后发生听觉中枢重组的重要基本原理之一[6-11]。这种发生在中枢听觉神经元的“增益”效应虽然在一定程度上有助于弥补听觉缺陷，但有时难免会引发耳鸣症状[14]。

在正常动物的听觉测试中，每只动物测得的ABR阈值总是等于或略高于其CAP阈值，但ABR反应阈却不会低于CAP的反应阈。在耳蜗毛细胞被噪声刺激破坏的早期，中枢听觉神经元尚未实现功能性重组，因此ABR阈值可等于或略高于CAP阈值。尽管ABR阈值和CAP阈值可能略有差别，但是这种微小的差别通常并不影响对实验前后的ABR阈移或CAP 阈移进行其自身在实验前后的对比。本实验发现窄带噪声暴露后1 h和2周，所有动物各频率诱发的ABR阈值及CAP阈值变化情况基本保持一致；但在噪声暴露后4周，5只发生噪声引起耳蜗损害动物中至少有3只动物对某些频率短纯音声刺激诱发的ABR阈值开始有所降低，而此时这些动物的CAP阈值却因毛细胞的永久性破坏而不可能恢复。说明由于耳蜗毛细胞的破坏引起的CAP阈值升高是一种不可逆性听觉障碍，但是脑干听觉中枢的神经元在耳蜗周边发生永久性损害后却仍然有可能随着听觉中枢的功能重组使其听觉水平逐渐提高。

在正常南美栗鼠的CAP测试中，CAP波形中仅出现N1和N2两个负向波，一般情况下不能从安放在圆窗龛的CAP测试电极引导出ABR波形。值得注意的是，本实验在噪声暴露后4周，从1只耳蜗毛细胞遭到严重破坏的南美栗鼠看到在其CAP波形中混入了ABR的波形成分，而且该波形中的ABR阈值明显低于CAP阈值。考虑到该动物的对侧耳蜗早先就已成功毁损，因此认定从圆窗龛电极引导出的ABR波形只能是来源于测试耳。我们对这一反常现象的理解是，在正常情况下，由于圆窗龛电极的位置十分接近耳蜗内电场而距离脑干听觉通路相对较远，因此只能记录到明显的CAP信号而不可能引导出远处脑干听觉神经元发放的微弱ABR信号。然而一旦这只动物因耳蜗毛细胞发生严重破坏导致了CAP的大幅度阈移，并致使距离圆窗龛电极较近的CAP信号明显减弱；但是脑干的中枢听觉神经元随后发生的听觉功能重组使之提高了对周边传入微弱听觉信号的探测灵敏度，引起脑干神经元兴奋，从而可在圆窗龛电极引导出大于CAP信号的ABR电位波形，并可测试到低于该动物CAP反应阈的ABR反应阀。

综上所述，当噪声过度刺激造成耳蜗毛细胞损害后，必定引起不可逆性CAP阈值升高。但是，在一定条件下，当耳蜗周边的听觉信号减弱而脑干的听觉神经元对来自周边的微弱信号相应上调灵敏度时，即使CAP信号减弱到难以探测，但仍有可能因中枢听觉重组而使中枢听觉神经元获得足够增益，并激发对听觉信号的有效感应，从而可从安放在圆窗龛的CAP记录电极或颅顶的记录电极引导出ABR信号。这一现象提示，听觉中枢发生重组后不仅可记录到近电场记录的下丘神经动作电位有所增强[6-8]，还有可能观察到ABR的测试结果与CAP不一致的现象。也就是说，ABR所反映的听觉功能状态在发生中枢听觉重组之后可能会略高于耳蜗周边的听觉水平。

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2010-12-08)

(本文编辑 杨美琴)

Changesintoneburstevokedauditorybrainstemresponsebynoiseexposure

WUXue-wen1,2，DINGDa-lian1,2,3，JIANGHai-yan2，LIUHong1,2，EdLobarinas2，SUNHong3，RichardSalvi2DepartmentofOtolaryngologyHeadandNeckSurgery,theThirdXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410013,China

Corresponding author：DING Da-lian,Email:dding@buffalo.edu

ObjectiveTo investigate the auditory plasticity-induced functional changes in auditory brainstem response(ABR)following the noise exposure.MethodsTen chinchillas were randomly divided into two groups,and exposed to 105 dB SPL octave band noise centered at 4 kHz for 2 or 5 hours respectively.ABR and compound action potentials (CAP) were recorded prior to noise exposure,and 1 hour,2 weeks,4 weeks after noise exposure.Stimuli were presented in ascending order of frequency (in octave steps from 1 kHz to 16 kHz).Hair cell counts (cyto-cochleograms) were performed from cochlear surface preparation under light microscope.ResultsExposure to 105 dB SPL narrow-band noise for a period of time caused various ranges of permanent damage in the cochlear hair cells.The thresholds of ABR and CAP in response to different frequencies tested were elevated which were consistent to the location of hair cell missing.Four weeks after noise exposure,in some animals,permanent threshold shifts were detected from CAP recording,however,ABR thresholds were partially recovered in some frequencies.In one animal,ABR was detected after CAP waveform with a lower threshold than the CAP.ConclusionsThe plasticity and reorganization of central auditory system may enhance the sensitivity of brainstem auditory neurons to the feeble signal input from the damaged cochlea.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:72-76)

Narrow-band noise; Auditory brainstem response; Compound action potential; Central auditory plasticity; Chinchilla

1.中南大学湘雅三医院耳鼻咽喉-头颈外科 长沙 410013

2.Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo， New York 14214

3.中南大学湘雅医院耳鼻咽喉-头颈外科 长沙 410008

丁大连(Email:dding@buffalo.edu)