后极部巩膜层间铁异物植入对兔眼生理生化的影响△

宥永胜 沈丽君 秦华 高潮 范巍 刘洋 陈亦棋

·基础研究·

后极部巩膜层间铁异物植入对兔眼生理生化的影响△

宥永胜 沈丽君 秦华 高潮＊范巍 刘洋 陈亦棋

目的通过兔眼电生理检查及房水、玻璃体铁离子浓度的检测，评估后极部巩膜层间铁异物植入对兔眼生理生化的影响。方法选取健康成年日本大耳白兔12只，随机分成两组。以右眼为对照眼，左眼为实验眼。制备2.0 mm×1.0 mm×0.2 mm中碳铁片，经眶路植入兔左眼后极部巩膜板层内。第一组植入无锈中碳铁片，第二组植入有锈中碳铁片。分别在植入前1周及术后1周、2周、1个月、3个月，对双眼进行闪光视网膜电流图(F-ERG)和闪光视觉诱发电位(F-VEP)检查。在实验结束处死前，抽取兔眼房水和玻璃体并设置空白对照，检测其中的铁离子浓度。运用统计软件SPSS 16.0，采用方差分析，对检测结果进行统计分析。结果暗视F-ERG混合反应a波振幅不同时间点之间比较差异无统计学意义(F=1.885，P=0.129)，不同处理组之间比较差异也无统计学意义(F=1.188，P=0.340)；b波振幅差异无统计学意义(时间因素F=2.73，P=0.064；处理因素F=1.114，P=0.367)； F-VEP N1波潜时(时间因素F=1.605，P=0.263；处理因素F=1.556，P=0.314)、P1波潜时(时间因素F=2.329，P=0.092；处理因素F=2.186，P=0.103)差异均无统计学意义。房水铁离子浓度各组差异有统计学意义(F=3.791，P=0.022)，其中有锈铁片组与空白对照组比较差异有统计学意义(t=3.32，P=0.004)。玻璃体铁离子浓度各组差异有统计学意义(F=3.694，P=0.023)，其中有锈铁片组与空白对照组(t=2.84，P=0.01)、无锈铁片组与空白对照组(t=3.23，P=0.005)比较差异有统计学意义。结论在3个月实验期内，兔眼后极部巩膜层间细小铁异物无论氧化与否，均没有对视网膜视神经造成明确的电生理改变，但房水、玻璃体铁离子浓度较铁异物植入前有明显升高。(中国眼耳鼻喉科杂志，2011，11：77-81)

巩膜层间铁异物；电生理检查；铁离子浓度；兔眼

铁是异常活跃的金属，在眼外伤患者中铁异物伤占据很大的比例，给眼球的结构和功能造成很大的损害。临床上偶尔会碰到一些赤道后巩膜层间铁异物伤患者，因为异物未穿透巩膜全层，对玻璃体、视网膜等眼内组织未造成直接损伤，故该类患者往往视力较好，也无明显不适。由于异物毗邻视神经，手术取出难度较大，且容易损伤视神经。此异物是否需要早期手术取出及何时取出等目前尚存有很大争议，由于缺乏理论依据，结果不一而终。本课题是模拟该类眼外伤患者，通过动物实验简单揭示后极部巩膜层间铁异物对眼球生理生化产生的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年日本大耳白兔12只，由温州医学院实验动物中心提供，体质量2～3 kg，雌雄不限(有孕雌兔除外)。编号后采用随机数据表随机分成2组，每组6只：第1组为无锈铁片组；第2组为有锈铁片组。第1组术中将无锈铁片置入兔左眼后极部巩膜板层内，第2组是将无锈铁片氧化生锈后植入兔左眼同样位置，以右眼作对照。实验结束时，购置日本大耳白兔3只，作为铁离子浓度检测的空白对照组。

1.2 后极部巩膜层间铁异物动物模型的建立 实验动物肌内注射速眠新II代注射液(0.2 mL/kg)，2 min后，腹腔注射10%水合氯醛(1 mL/kg)。待其肌肉松弛，角膜反射、疼痛反射基本消失后，进行如下操作：①兔左眼结膜囊滴入0.5%爱尔卡因滴眼液2次，开睑器开睑，盐酸林可霉素滴眼液冲洗结膜囊；②手术显微镜下，鼻侧角巩膜缘缝线牵引，剪开鼻侧球结膜，断开内直肌，充分暴露后极部巩膜；③距角膜缘8 mm做2 mm×2 mm板层巩膜瓣；④巩膜瓣下植入制备好的2.0 mm×1.0 mm×0.2 mm无锈中碳铁片，8-0可吸收缝线缝合巩膜瓣4针固定异物；⑤缝合内直肌及球结膜。同法植入有锈中碳铁片。术后给予妥布霉素滴眼液，3次/d，预防感染。 为了明确铁异物是否植入兔眼后极部巩膜内，术后采用眼眶CT扫描、眼部B超验证(附2页图1和图2)。

1.3 电生理检测 应用ROLAND多功能视觉电生理记录系统。视网膜电图 (flash electroretinogram，F-ERG) 主要器材：ERG-jet金箔角膜接触镜电极2只，不锈钢针电极2个。电极安放：角膜接触镜电极内滴入人工泪液作为耦合剂，分别置于两眼角膜正中，两根参考电极分别置于前额正中和左耳尖皮下。记录参数：通频带宽1～300 Hz，刺激强度1.6 log·cd·s·m-2，记录时间250 ms，单次闪光记录。视觉诱发电位(flash visual evoked potential，F-VEP) 主要设备器材：不锈钢针电极3个。电极安放：记录电极置于两耳跟连线中点处骨膜下，参考电极置于两眼连线中点处骨膜下,接地电极置于同侧耳尖皮下。记录参数：通频带宽5～100 Hz，间隔1 s闪光1次，刺激强度1.6 log·cd·s·m-2，叠加50次。

实验方法：①麻醉成功后安装电极(麻醉方法同上)，先行铁异物眼F-VEP检测并记录数据，再检测对照眼；②复方托吡卡胺滴眼液滴双眼散瞳，暗室内加盖遮光布暗适应1 h；③安放电极进行暗视F-ERG检测并记录实验数据。实验数据：F-ERG按国际标准测量a波、b波潜时(T，ms)和振幅(A，μV)，波潜时值是从闪光刺激开始到反应波峰时间，a波振幅是从基线测量到a波波谷，b波振幅是从a波波谷到b波波峰。F-VEP的N1波、P1波潜时测量是从光刺激开始到反应波峰的时间，振幅测量是从前一个波峰(或谷)到相邻的后一个波谷(或峰)。记录时间点：铁异物植入前1周及植入后1周、2周、1个月、3个月。

1.4 房水、玻璃体铁离子浓度的检测 在实验结束时，抽取每只兔眼的房水、玻璃体，并设置空白对照组，检测其中的铁离子浓度并进行比较。同时观察兔眼铁异物的位置及其反应情况。

房水、玻璃体样本采集：①全身麻醉，常规消毒，结膜囊滴入0.5%爱尔卡因滴眼液2次，开睑器开睑，盐酸林可霉素滴眼液冲洗结膜囊；②手术显微镜下，用1.0 mL一次性注射器自角膜缘刺入前房，抽取房水0.1 mL，注入标记好的玻璃试管中封闭待查；③显微玻璃体视网膜穿刺刀距角膜缘约1.5 mm处刺入玻璃体腔，20 G玻璃体切割头自该切口进入，在切割玻璃体的同时用1.0 mL注射器连接抽吸管抽取玻璃体0.3 mL，注入标记好的玻璃试管中封闭待查。

房水、玻璃体铁离子浓度测定委托温州医学院分析测试中心进行。检测方法：①用天平赛多利斯(Sartorius CPA 224s max 220 g)给房水、玻璃体准确称重后置于10 mL试管中，利用湿法消解，然后往试管中加入2 mL浓HNO3和1 mL 30%H2O2，放置过夜。利用自控电热消化器程序升温消解，最高消解温度240 ℃，至近干时停止加热，冷却后用2%的HNO3介质定容至10 mL，同时做空白试验。②工作曲线制作：配置母液浓度为300 ng/mL，然后用体积分数2%的HNO3介质系统自动稀释配置50、100、150、200、300 ng/mL 5个标准浓度，做标准曲线；曲线的相关系数按新合理拟合，相关系数r= 1.000 0，Abs = 0.000 63×c，检测房水、玻璃体铁离子浓度。

2 结果

2.1 电生理检查的比较 由于电生理检查的波形及内容较多，故选取有代表意义的暗视F-ERG混合反应a波、b波振幅及F-VEP N1波、P1波潜时作为检查指标进行统计分析。因为随着实验时间的延长，电生理检查结果可能会发生变化，所以对同一处理因素不同时间点的检查结果分别进行比较(表中以时间因素表示)。同时比较了有锈、无锈铁片眼及其对照眼的检查结果(表中以处理因素表示)，而处理因素和时间因素之间的交互作用在表中以处理＊时间表示。

通过实验发现，暗视F-ERG混合反应a波、b波振幅，无论每个时间点不同处理组之间的比较，还是5个时间点之间比较，差异均无统计学意义。虽然随着实验时间的延长，有锈铁片组和无锈铁片组的F-VEP N1波、P1波潜时均存在延长的趋势，但与其他时间点比较差异无统计学意义，且每个时间点不同处理组之间比较差异也无统计学意义，详见表1～4。

表1 各处理组不同时间点暗视F-ERG混合反应a波振幅的比较(μV)

表2 各处理组不同时间点暗视F-ERG混合反应b波振幅的比较(μV)

表3 各处理组不同时间点F-VEP N1波潜时的比较(ms)

表4 各处理组不同时间点F-VEP P1波潜时的比较(ms)

2.2 铁离子浓度的比较 房水铁离子浓度各组差异有统计学意义，其中有锈铁片组与空白对照组比较差异有统计学意义(t=3.32，P=0.004)。玻璃体铁离子浓度各组差异有统计学意义，其中有锈铁片组与空白对照组(t=2.84，P=0.01)、无锈铁片组与空白对照组(t=3.23，P=0.005)比较差异有统计学意义，详见表5。

表5 不同处理组房水、玻璃体铁离子浓度(μg/g)的比较

2.3 铁异物包裹组织情况 实验结束时取出兔眼，检查发现后极部巩膜层间铁异物被周围组织包裹，未见明显移位，包裹组织及其周围未见明显铁锈沉着(附2页图3)。

3 讨论

视觉电生理检查是眼科临床和科研上应用较为广泛的一种客观评价视功能的方法。通常认为，在人眼中，F-ERG暗视混合反应中的a波可反映视网膜光感受器功能，b波反映视网膜双极细胞、Müller细胞等功能，故结合a、b波能很好反映视网膜的整体功能情况。在动物实验中记录F-ERG暗视混合反应，是评价视网膜功能很好的检测指标。VEP除了反应视网膜中央区域的功能外，主要用于检测视路的病变情况[1-2]。有学者[3-4]把电生理检查引入兔眼的视功能检测，给本实验的设计提供了参考。而张作明等[5]为ERG和VEP记录提供了标准化方案。

中碳铁是在小型铸造、模具生产等中小企业中应用最为广泛的材料之一，其性质活泼，在潮湿的环境中容易生锈。由于一些企业不太注重劳动防护，因而成为铁异物损伤的主要来源。铁异物损害最主要的表现是铁质沉着症，由于氧化铁与组织蛋白结合形成一种铁蛋白化合物，容易沉积于角膜实质和内皮、虹膜基质层、视网膜胶质及房角等外胚叶来源的组织中，并产生锈染侵害[6-7]。为了明确有锈铁是否比无锈铁损害严重，本实验设置了两组。因为在球壁异物的定位方法中，B超可以显示异物及眼球壁的两者关系，能准确地判定球壁异物，但以CT对球壁异物的定位和诊断最为准确[8]。所以，本实验选择CT和B超作为铁异物是否植入后极部巩膜的评判方法。

Sieving等[9]在研究铁质沉着症对眼外伤患者的损害时，发现ERG是检测铁质沉着症早期视网膜损害很有价值的临床和实验工具，为本实验选择ERG和VEP作为后极部巩膜层间铁异物对视网膜视神经功能损害检测指标提供了依据。因为兔眼无法识别图形改变，故选取F-ERG和F-VEP作为电生理的检测方法。由于兔眼较小，前后径15～17 mm，平均16.3 mm[10]，所以本研究选择在鼻侧距离角膜缘8 mm处作板层巩膜瓣植入铁片，使其较接近且不损伤视神经。

通过实验发现兔眼ERG和VEP，无论每个时间点不同处理组之间的比较，还是5个时间点之间比较，差异均无统计学意义；但随着实验时间的延长，有锈铁片组和无锈铁片组的VEP N1波、P1波潜时均存在延长的趋势。说明在3个月的实验期内，后极部巩膜层间铁片产生的氧化铁弥散，可能改变了一小部分后极部视网膜的功能，但对视网膜视神经的总体功能没有产生明显影响。在3个月实验结束时，取出实验眼，检查发现巩膜层间铁片产生了明显的组织包裹。这可能是其没有产生移位的重要原因之一，同时组织包裹影响了氧化铁向视网膜及其他眼内组织的弥散，也从另一个侧面验证了电生理的检查结果。但在分析实验结束时，房水、玻璃体铁离子浓度检测结果发现，两者在铁异物植入眼均高于空白对照眼，说明短期内后极部巩膜层间铁异物对房水、玻璃体的铁离子含量产生了较大影响。另外，实验中还发现，由于取样时异物对照眼的一只眼房水及另一只眼玻璃体样本中渗入了少量血液，造成检测到的铁离子浓度分别为其均值的3倍左右，给结果分析产生了很大的影响，需剔除后才能得出正确的统计分析。所以，进行房水、玻璃体铁离子浓度检测实验，采样时一定要避免样本中渗入血液。

Konstantinidis等[11]通过对2例球壁铁异物患者随访观察4～6年，发现铁异物产生了明显的纤维包裹，且患者视力维持在1.0的水平，随访ERG也相对稳定。本研究在3个月实验期内，兔眼后极部巩膜层间细小铁异物，无论氧化与否均没有对视网膜视神经造成明确的电生理改变。虽然房水、玻璃体铁离子浓度较铁异物植入前有明显升高，但何时产生铁质沉着症尚需进一步观察。提示临床上遇到类似的铁异物伤，假如异物较小且毗邻视神经，短期内可以不必冒损伤视神经的风险强行取出，但必须进行密切的随访观察。由于兔眼的解剖结构与人眼存在一定差异，本研究结果对眼科临床的指导意义尚需在临床工作中加以验证。

[1]吴德正.视觉电生理// 李凤鸣.中华眼科学(上册)[M].2版.北京:人民卫生出版社,2004:370-385.

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[3]段俊国,刘文舟,周华祥,等.单眼视神经离断家兔ERG和VEP表现[J].临床神经电生理学杂志,2005,14(2):93-94.

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[5]张作明,顾永昊,郭群,等.小鼠与大鼠视网膜电图和闪光视觉诱发电位记录标准化方案建议[J].眼科新进展,2004,24(2):81-83.

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2010-12-09)

(本文编辑 诸静英)

Impactofposteriorintrascleralironforeignbodyonrabbiteyes’physiologicalandbiochemicalfunctions

YOUYong-sheng，SHENLi-jun，QINHua，GAOChao＊，FANWei,LIUYang，CHENYi-qi.DepartmentofOphthalmology,HospitalofOptometryandOphthalmology,WenzhouMedicalCollege，Wenzhou325027,China

Corresponding author：SHEN Li-jun,Email:slj@mail.eye.ac.cn

ObjectiveTo evaluate the effect of posterior intrascleral iron foreign body on rabbit eyes’ physiological and biochemical functions by electrophysiologic examination as well as ferri ion concentration measurement in aqueous humor and vitreous body.MethodsTwelve healthy adult Japan flap-eared white rabbits were randomly divided into two groups,the left eye was used as the experimental eye and the fellow eye as control.The medium carbon iron with the size of 2.0 mm×1.0 mm×0.2 mm was implanted into the posterior sclera of the rabbit’s left eye through the orbit.The first group was implanted with medium carbon iron without rust,and the second group with medium carbon iron with rust.Flash electroretinogram (F-ERG) and flash visual evoked potential (F-VEP) were examined for both eyes 1 week earlier before iron implantation and 1 week,2 weeks,1 month and 3 months after the implantation.Furthermore,the aqueous and vitreous ferri ion concentration in each eye was measured before sacrifice at the end of the experiment,and the blank control group was set simultaneously.SPSS 16.0 software package was used for statistic analysis by variance anova.ResultsThere were no statistical difference for the a-wave amplitude of F-ERG scotopic response compared each other at different time points (F=1.885，P=0.129) and different treatment groups (F=1.188，P=0.340).So did the ERG b-wave amplitude (Time FactorF=2.73，P=0.064；Treatment FactorF=1.114，P=0.367).There weren’t statistical difference for F-VEP N1-wave latent period (Time FactorF=1.605，P=0.263；Treatment FactorF=1.556，P=0.314) and P1-wave latent period (Time FactorF=2.329，P=0.092；Treatment FactorF=2.186，P=0.103).The aqueous ferri ion concentration was statistically significant among groups (F=3.791，P=0.022),and there was statistical difference between iron with rust group and blank control group(t=3.32，P=0.004).So did the vitreous ferri ion concentration (F=3.694，P=0.023).There was statistical difference between iron with rust group and blank control group(t=2.84，P=0.01) and between iron without rust group and blank control group(t=3.23，P=0.005).ConclusionsThere was no definite electrophysiological change of the rabbit eyes caused by the posterior intrascleral iron foreign body with or without rust in the experimental period of three months,but ferri ion concentration of aqueous and vitreous was obviously higher than that before iron foreign body implantation.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:77-81)

Intrascleral iron foreign body；Electrophysiological examination；Ferri ion concentration；Lagophthalmos

温州市科学技术局计划项目资助(Y20070082)

温州医学院附属眼视光医院眼科 温州 325027

＊浙江省瑞安市康明眼科医院眼科 瑞安 325200

沈丽君(Email:slj@mail.eye.ac.cn)