徐雅君 曾庆友,2* 许瑞安*
(1 教育部分子药物工程研究中心、华侨大学分子药物学研究所,福建 泉州 362021;2 华侨大学化工学院,福建 泉州 362021)
细胞膜穿透肽(cell penetrating peptide,CPPs)是一些具有细胞穿透功能的短肽的统称,一般少于30个氨基酸,其中碱性氨基酸占多数[1]。此外,CPPs还能帮助生物大分子穿过血脑屏障且无毒副作用[2,3]。CPP的这些特性使其成为一种有效的运输载体,向细胞内运送各种自身不能穿越细胞膜的大分子生物活性物质,为生物治疗提供了一个崭新的有力工具。到目前为止,已有CPPs作为载体成功的将多肽、蛋白质、DNA及siRNA等导入细胞内的报道[4-7]。但是随着研究的深入,我们发现CPPs作为载体,存在与血液的不相容性,缺少组织特异性,易被内体捕获从而进入溶酶体被降解等问题[8,9],从而大大的降低了CPPs的转染率,限制了其在肿瘤治疗中的应用。因此,有效解决上述问题是优化CPPs在肿瘤治疗中的作用的关键。
CPP本身具有生物组织相容性且无毒副作用。但是,在体内给药时,由于CPP中碱性氨基酸占多数,所以,其在生理pH 7.4条件下带正电荷,易与血液发生作用,引起血栓,从而对人体造成伤害,甚至引发死亡[10,11]。因此,在用CPP作载体,进行体内给药时,我们要首先对CPP进行修饰来掩盖其表面的正电荷。载体表面修饰,最常用的方法是聚乙二醇化,聚乙二醇不仅具有很好的生物相容性,还可以增强载体在体内的稳定性并延长其体内循环时间,从而提高药效。Morris等[12]将细胞膜穿透肽Pep-3聚乙二醇化,并证实了修饰后的Pep-3在体内的稳定性较未修饰的大大的提高了。Van Dongen等[13]也将细胞膜穿透肽Tat和聚乙二醇化联合起来使用,来提高酶载纳米反应器的转染率。
CPP本身是没有组织特异性的,所以在进行体内给药时,CPP会带着负载的药物会进入所有组织,这样就会使到达靶组织的药物浓度减少[8,14,15]。此外,抗肿瘤药物一般上对正常组织会有伤害作用,所以,在治疗肿瘤的时候我们要尽量使抗肿瘤药物具有靶向性,能直达肿瘤组织起作用。理论上来说,解决CPP的肿瘤靶向性的问题并不难,但实际上,解决这个问题是一难点。因为在组织中,CPP和接上的配体的作用是相互抑制的。Anderson等[16]将Fab片段与Tat相连,并证实Fab连接后的Tat确实具有细胞靶向性,但是这个研究同时也指出Fab抑制Tat的穿膜能力,而Tat也抑制Fab寻找靶细胞的能力,二者之间存在矛盾。如何解决CPP与配体之间的矛盾呢?首先,我们要考虑到二者的发挥作用的空间的差异,配体是在组织外作用,以达到寻找靶组织的目的;CPP是在细胞膜上起作用,以达到跨膜的目的。其次,我们要考虑到正常组织与靶组织之间的生理差异,如pH的不同,肿瘤特异的酶。最后,我们就可以根据上述两方面得到一种可行的策略,对CPP进行修饰改造。Jiang等[17]用阴离子多肽将聚精氨酸多肽掩盖,从而使聚精氨酸不能发挥作用,进入细胞;直到到了肿瘤组织,由于肿瘤组织特异性酶MMP2的存在,切断了阴离子多肽与聚精氨酸之间的连接,聚精氨酸暴露发挥作用,从而进入肿瘤细胞。
因此,CPP作为载体应用于体内治疗时,应考虑先将CPP掩盖,直至到达靶组织时,再将其释放。这样才能使CPP的作用得到很好的发挥,而且将对机体组织的伤害降到了最低。
CPP最初被认为是以非温度依赖、非能量依赖、非受体依赖的方式进入细胞的[18,19]。但从2003年后,人们逐渐发现了细胞内吞作用在CPP应用试验中的存在,并且最终确认内吞作用是CPP介导药物进入细胞的主要方式,而直接穿膜作用也是进入细胞的方式之一[20,21]。因此,CPP介导的跨膜作用包括很多途径,而途径的选择不仅与CPP种类及负载药物的性质有关,而且与靶细胞的种类有关[22-24]。此外,又由于至今为止CPP的跨膜机制还不明确,所以,对于目前的状况来说,在细胞实验前确定某一具体的CPP及其负载物进入细胞的途径几乎是不可能的,而这种不确定又在很大程度上增加了时间的耗费和成本。解决这个问题的关键就是要明确CPP的跨膜机制。
目前已提出了很多CPP的跨膜机制,主要包括3类。第一种是通过静电作用直接渗透通过细胞膜。具体过程为未折叠的CPP融合蛋白首先与细胞膜表面通过静电方式结合,然后直接跨过细胞膜,接着在分子伴侣的帮助下发生重折叠[25,26]。这是针对早期研究发现的认为CPP是非温度依赖、非能量依赖、非受体依赖的非经典内吞方式的跨膜机制。第二种跨膜机制是通过形成某种跨膜结构发生转导进入细胞。这类机制包括3种可能的模式[27]:反转微团模式、地毯模式和打孔模式。第三种跨膜机制是内吞作用介导入膜,这类机制是在发现CPP跨膜过程中涉及内吞作用后提出的[28-30]。
虽然现在CPP的跨膜机制还不明确,但是其穿膜特性是肯定的。此外,人们还开始认识到CPP的一次跨膜并不仅仅涉及一种跨膜机制[31]。有很多机制参与CPP的一次跨膜,重要的是哪种机制为主。因此,目前的重点是明确跨膜机制,然后根据其来改造CPP,使其主要按人们想要的那种机制跨膜。
虽然CPP的一次跨膜涉及很多机制,但是人们发现至今为止应用的CPP负载药物跨膜都以内吞作用跨膜为主,而又由于内吞作用跨膜时存在内体捕获和溶酶体降解的问题,所以,我们就要考虑如何帮助CPP及其负载物从内体逃脱,以防止其进入溶酶体,从而在溶酶体堆积或被降解[32,33]。
促进CPP从内体逃逸的方法主要有5种:①化学物质辅助逃逸,如氯喹、Ca2+等。Wattiaux等[34]用荧光标记Tat,并在细胞培养基中加入氯喹,几小时后在细胞质和细胞核中发现了荧光,首次证实了氯喹可以促进CPP从内体逃脱进入胞质,进入细胞核。Shiraishi等[35]发现在培养基中加入Ca2+能促进CPP偶联的PNA从内体释放。虽然Ca2+能明显促进CPP从内体逃脱,但其作用机制仍不清楚。②光敏物质辅助逃逸。光敏物质能在可见光的激发下产生活性氧簇,而活性氧簇能破坏内体膜,促进内体内物质释放进入胞质。因此,应用CPP作为载体运送生物活性物质进入细胞内的同时给予光敏物质可促进内含体内含物的释放。Endoh等[36]将siRNA连接到CPP上,在激光的照射下,CPP成功将siRNA导入到CHO细胞,诱导U1A基因的沉默。③天然或合成的聚合物辅助逃逸,例如蜂毒肽及人工合成的短肽如43E(LAEL-LAELLAEL)。Ogris等[37]将蜂毒肽结合到聚乙烯亚胺PEI上,形成MELPEI-DNA复合物,发现蜂毒肽能促进DNA从内体释放到胞质,并引导其跨过核膜屏障进入细胞核。④病毒微生物辅逃逸,例如流感病毒血凝素2蛋白(HA2)。一些病毒微生物在进化过程中获得了从内体逃逸的本领,而这种逃逸与微生物自身元件在低pH值环境中,破坏内含体溶酶体膜有关[38]。Sugita等[39]用荧光素标记TAT,分别处理细胞,发现TAT单独处理时荧光只是集中在内体,而与TAT-HA2共处理后则发现细胞质中有大面积荧光。⑤ CPP自身改造促进逃逸[40,41]。虽然上述5种方法能促进CPPs及其负载物从内体逃逸,但却存在操作繁琐、运送载体构造复杂及毒副作用较大等缺点。因此,人们开始寻找更简便、更安全的方法来促进CPP的内体逃逸,对现有CPPs进行改造是最可行的方法。目前已提出很多关于CPP改造的方案,也已对很多方案进行试验验证,虽然有所进展,但仍缺少实质性的突破。
细胞膜穿透肽可以有效地将多肽、蛋白质及DNA片段等生物大分子导入多种哺乳动物细胞,且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。目前,虽然CPP在应用过程中存在很多的问题,甚至CPP的跨膜机制也不明确,这是造成很多问题的关键。但是仍可以肯定CPP是生物活性分子有效的细胞内转运工具,而且我们有理由相信,经过改造的CPP,未来的CPP将作为高效的生物药物输送载体,在疾病的预防、检测及治疗中发挥重要的作用[42]。
[1] Lindgren M,Hallbrink M,Prochiantz A,et al.Cell-penetrating peptides[J].Trends Pharmacol Sci,2000,21(3):99-103.
[2] Schwarze SR,Ho A,Vocero-Akbani A,et al.In vivo protein transduction:delivery of a biologically active protein into the mouse[J].Science,1999,285(5433):1569.
[3] Fominaya J,Gasset M,García R,et al.An optimized amphiphilic cationic peptide as an efficient non-viral gene delivery vector[J].J Gene Med,2000,2(6):455-464.
[4] Fawell S,Seery J,Daikh Y,et al.Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells[J].Proceed Nat Acad Sci,1994,91(2):664.
[5] Pooga M,Kut C,Kihlmark M,et al.Cellular translocation of proteins by transportan[J]. FASEB J,2001,15(8):7801.
[6] Hansen M,Kilk K,Langel U.Predicting cell-penetrating peptides[J].Adv Drug Delivery Reviews,2008,60(4/5):572-579.
[7] Lundberg P,El-Andaloussi S,Sütlü T,et al.Delivery of short interfering RNA using endosomolytic cell-penetrating peptides[J].FASEB J,2007,21(11):2664.
[8] Vivès E,Schmidt J,Pèlegrin A.Cell-penetrating and cell-targeting peptides in drug delivery[J]. Biochim Biophys Acta,2008,1786(2):126-138.
[9] Räägel H,Säälik P,Pooga M.Peptide-mediated protein delivery-Which pathways are penetrable?[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,2010,1798(12):2240-2248.
[10] Lee H,Pardridge W.Pharmacokinetics and delivery of tat and tatprotein conjugates to tissues in vivo[J].Bioconjugate Chem,2001,12(6):995-999.
[11] Ma SF,Nishikawa M,Katsumi H,et al.Cationic charge-dependent hepatic delivery of amidated serum albumin[J].J Control Release,2005,102(3):583-594.
[12] Morris MC,Gros E,Aldrian-Herrada G,et al.A non-covalent peptide-based carrier for in vivo delivery of DNA mimics[J].Nucleic Acids Res,2007,35(7):e49.
[13] van Dongen S, Verdurmen WP,Peters RJ,et al.Cellular Integration of an Enzyme-Loaded Polymersome Nanoreactor[J].Angew Chem Int Ed Enql,2010,49(40):7213-7216.
[14] Vivès E,Brodin P,Lebleu B.A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus[J].J Biol Chem,1997,272(25):16010.
[15] Niesner U,Halin C,Lozzi L,et al.Quantitation of the tumor-targeting properties of antibody fragments conjugated to cell-permeating HIV-1 TAT peptides[J].Bioconjugate Chem,2002,13(4):729-736.
[16] Anderson DC,Nichols E,Manger R,et al.Tumor cell retention of antibody Fab fragments is enhanced by an attached HIV TAT protein-derived peptide[J].Biochem Biophys Res Commun,1993,194(2):876-884.
[17] Jiang T,Olson ES,Nguyen QT,et al.Tumor imaging by means of proteolytic activation of cell-penetrating peptides[J].Proceed Nat Acad Sci,2004,101(51):17867.
[18] Derossi D,Calvet S,Trembleau A,et al.Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptorindependent[J].J Biol Chem,1996,271(30):18188.
[19] Suzuki T,Futaki S,Niwa M,et al.Possible existence of common internalization mechanisms among arginine-rich peptides[J].J Biol Chem,2002,277(4):2437.
[20] Drin G,Cottin S,Blanc E,et al.Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides[J].J Biol Chem,2003,278(33):31192.
[21] Richard JP,Melikov K,Brooks H,et al.Cellular uptake of unconjugated TAT peptide involves clathrin-dependent endocytosis and heparan sulfate receptors[J].J Biol Chem,2005,280(15):15300.
[22] Brooks N,Pouniotis DS,Tang CK,et al.Cell-penetrating peptides:Application in vaccine delivery[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Reviews on Cancer,2009,1805(1):25-34.
[23] Bárány-Wallje E,Gaur G,Lundbergb P,et al.Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo[J].FEBS Lett,2007,581(13):2389-2393.
[24] Ziegler A.Thermodynamic studies and binding mechanisms of cell-penetrating peptides with lipids and glycosaminoglycans[J].Adv Drug Delivery Reviews,2008,60(4/5):580-597.
[25] Veach RA,Liu D,Yao S,et al.Receptor/transporter-independent targeting of functional peptides across the plasma membrane[J].J Biol Chem,2004,279(12):11425.
[26] Drin G,Cottin S,Blanc E,et al.Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides[J].J Biol Chem,2003,278(33):31192.
[27] Lundberg P,Langel U.A brief introduction to cell-penetrating peptides[J].J Mol Recogn,2003,16(5):227-233.
[28] Richard JP,Melikov K,Vives E,et al.Cell-penetrating peptides.A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. [J].J Biol Chem,2003,278(1):585-590.
[29] Lundberg M,Johansson M.Is VP22 nuclear homing an artifact?[J].Nat Biotechn,2001,19(8):713-713.
[30] Lundberg M,Wikstrm S,Johansson M.Cell surface adherence and endocytosis of protein transduction domains[J].Mol Ther,2003,8(1):143-150.
[31] Guterstam P,Madani F,Hirose H,et al.Elucidating cell-penetrating peptide mechanisms of action for membrane interaction,cellular uptake,and translocation utilizing the hydrophobic counter-anion pyrenebutyrate[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes,2009,1788(12):2509-2517.
[32] Nakase I,Niwa M,Takeuchi T,et al.Cellular uptake of arginine-rich peptides:roles for macropinocytosis and actin rearrangement[J].Mol Ther,2004,10(6):1011-1022.
[33] Magzoub M,Pramanik A,Graslund A.Modeling the Endosomal Escape of Cell-Penetrating Peptides:Transmembrane pH Gradient Driven Translocation across Phospholipid Bilayers[J].Biochemistry,2005,44(45):14890-14897.
[34] Wattiaux R,Gentinne F,Jadot M,et al.Chloroquine allows to distinguish between hepatocyte lysosomes and sinusoidal cell lysosomes[J].Biochem Biophys Res Commun,1993,190(3):808-813.
[35] Shiraishi T,Pankratova S,Nielsen P.Calcium ions effectively enhance the effect of antisense peptide nucleic acids conjugated to cationic tat and oligoarginine peptides[J].Chem Biol,2005,12(8):923-929.
[36] Endoh T,Sisido M,Ohtsuki T.Photo inducible RNA interference using cell permeable protein carrier[J].Nucleic Acids Symp Ser(Oxf),2007(51):127-128.
[37] Ogris M,Carlisle RC,Bettinger T,et al.,Melittin enables efficient vesicular escape and enhanced nuclear access of nonviral gene delivery vectors[J].J Biol Chem,2001,276(50):47550.
[38] Skehel J.Influenza fusion peptides[J].Neuroreport,1999,9:1749-1755.
[39] Sugita T,Yoshikawa T,Mukai Y,et al.Improved cytosolic translocation and tumor-killing activity of Tat-shepherdin conjugates mediated by co-treatment with Tat-fused endosome-disruptive HA2 peptide[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,363(4):1027-1032.
[40] Lo SL,Wang S.An endosomolytic Tat peptide produced by incorporation of histidine and cysteine residues as a nonviral vector for DNA transfection[J].Biomaterials,2008,29(15):2408-2414.
[41] Abes S,Moulton HM,Clair P,et al.Vectorization of morpholino oligomers by the (R-Ahx-R) 4 peptide allows efficient splicing correction in the absence of endosomolytic agents[J].J Control Release,2006,116(3):304-313.
[42] 许瑞安,陈凌,肖卫东.分子基因药物学[M].北京:北京大学出版社 & 北京大学医学出版社联合出版,2008.