甲壳素生产废水提取虾青素及水解蛋白的工艺研究

刘汉文 王爱民 陈洪兴 张其林

小龙虾学名克氏原螯虾，俗称淡水小龙虾。每只龙虾的可食比率为20%～30%，但是在国内的小龙虾加工中，除将虾壳加工为甲壳素，甲壳素脱乙酰化后再制成壳聚糖外，较少进行综合利用。虾壳酸碱交替法生产的甲壳素，虾青素与蛋白质流失于废水中，造成资源浪费和环境污染。壳聚糖分子中具有大量的游离氨基，在一定条件下，能够表现出阳离子型聚电解质的性质，具有强烈的絮凝作用，既有铝盐、铁盐消除胶粒外面负电荷的作用，又有以聚丙烯酰胺为代表的有机高分子类絮凝剂通过“桥联”使悬浮物凝聚的作用，因此，它能够使甲壳素生产废水中的悬浮物快速沉降，是一种天然、无毒、无味的高分子絮凝剂[1-2]。

虾青素，学名为3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′胡萝卜素，属于叶黄族酮式类胡萝卜素，易溶于有机溶剂，难溶于水，具有独特的着色、抗氧化、防癌[3-4]、促进抗体产生、抵御紫外线、改善视力、提高免疫力、促进色素形成以及改善生育等功能[5]。虾青素可作为人类高级营养保健品、医药产品及养殖动物的饲料添加剂，尤其在水产养殖业上，虾青素市场需求量很大。蛋白质是动物有机体结构和功能中重要的营养物质，是动物体生长和维持生命活动必需的营养素。近年来，动物性蛋白质饲料匮乏，给饲料工业的发展带来了不少困难。据联合国粮农组织(FAO)报道，当前在世界范围内蛋白质饲料严重不足，而且这种状况在逐年加剧。从废弃物中回收提取蛋白质是开发新的蛋白质饲料很重要的一条途径。

1 材料与方法

1.1 材料

小龙虾壳（盐城市邦尼水产食品有限公司生产）；壳聚糖(脱乙酰度≥90%，由国药集团化学试剂有限公司生产）；蛋白酶[食用级，由诺维信（中国）生物科技有限公司生产]。

1.2 试剂

盐酸、硫酸、冰醋酸、硼酸、氢氧化钠、五水硫酸铜、硫酸钾、二氯甲烷、无水乙醇、甲醛、甲基红、溴甲酚绿（以上试剂皆为分析纯）。

1.3 设备

电热真空干燥箱，型号为ZK-65；电热恒温水浴锅，型号为HHS；恒温干燥箱，型号为CS101-2E；分光光度计，型号为7202B；酸度计，型号为pHS-3C；旋转蒸发器，型号为RE-2000；均浆机，型号为JJ-2；喷雾干燥塔，型号为GZ-5；粉碎机，型号为SF-200；凯氏定氮装置、抽滤装置、磁力搅拌器、滴定装置等。

1.4 方法

1.4.1 工艺流程

1.4.2 采用酸碱交替法制备甲壳素

将小龙虾壳洗净，低温风干，粉碎。用2 mol/l盐酸溶液浸泡，搅拌，反应24 h，水洗至中性，盐酸具有脱去虾壳中的碳酸钙等无机物作用，同时虾壳中的油脂类会析出，虾青素就会进入溶液；再用过量10%NaOH煮沸1～2 h，水解除去虾壳中所含的蛋白质，与蛋白质结合的虾青素会随之溶出，水洗至中性，可制备甲壳素。

1.4.3 废水絮凝处理

收集甲壳素生产过程中废水，调节pH值，投入一定量的壳聚糖酸性溶液作为絮凝剂，搅拌2 min，静置一定时间，使虾青素与蛋白质絮凝沉淀，壳聚糖不会污染回收后的蛋白质，无需后续处理。

1.4.4 蛋白质的水解与虾青素的提取

在龙虾壳中，虾青素主要以酯化形式存在，所以用有机溶剂直接提取虾青素得率较低，在甲壳素生产废水的絮凝物中，部分虾青素仍与蛋白质以化学键的形式结合在一起，将虾青素与蛋白质絮凝物均浆，采用蛋白酶将蛋白质适度降解，蛋白质中结合的虾青素得以有效释放，本试验采用蛋白酶酶解后，以二氯甲烷为萃取剂，重复萃取多次至上清液无色，合并上清液，将萃取液转入蒸馏烧瓶中真空水浴加热回收二氯甲烷，至二氯甲烷完全回收。将固体物用乙醇溶解，过滤，利用虾青素在酸性条件下溶解度低的特性，用1 mol/l盐酸沉降虾青素，去上清液，如此反复2～3次，得到虾青素的纯净沉淀物[6-8]。将制得的纯净沉淀物放在50～55℃的真空干燥箱中烘干，得到鲜红色粉末状固体，即为虾青素提取物。最大量提取虾青素并使降解后的蛋白质成为富含游离氨基酸、小分子肽的水解蛋白。水解蛋白具有提高鲜度，增加风味的作用，将水解蛋白浓缩，喷雾干燥后，可作为动物蛋白及高档水产动物蛋白调味料。

1.4.5 测定项目及方法

1.4.5.1 絮凝效果的测定方法

取一定量的甲壳素生产过程中废水，放入三角瓶中，配制1%壳聚糖醋酸水溶液，在不同的pH值下，按一定的比例加入1%壳聚糖醋酸水溶液作为絮凝剂，静置一定的时间，布氏漏斗双层滤纸抽滤收集絮凝沉淀。抽滤液在730 nm的波长下用分光光度法测其吸光值，吸光值越低，絮凝效果越好[9]。

1.4.5.2 虾青素提取率

提取率（%）=(真空干燥后的虾青素提取物质量/风干小龙虾壳质量)×100。

1.4.5.3 蛋白质含量的测定

微量凯氏定氮法测蛋白质含量。

1.4.5.4 蛋白质的水解度

水解度（%）=（氨基态氮含量/总氮含量）×100。

氨基态氮含量的测定按《游离氨基氮甲醛快速滴定法》进行测定；总氮含量的测定采用微量凯氏定氮法。

2 结果与分析

2.1 小龙虾壳以酸碱交替法制备甲壳素废水的壳聚糖絮凝处理

2.1.1 调节pH值对废水的影响

分别取50 ml的废水，加入到三角烧瓶里，调节pH值2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，搅拌2 min，静置2 h，抽滤，抽滤液在730 nm处下测OD值。结果见图1，pH值为4时絮凝效果最好。

图1 pH值对废水OD值的影响

2.1.2 絮凝剂最佳用量的测定

取6等份（每份为50 ml）废水调节pH值为4.0，然后分别加入0、2、4、6、8 ml和10 ml的1%壳聚糖醋酸水溶液，然后搅拌2 min，静置2 h，抽滤，抽滤液在730 nm处下测OD值。结果见图2，加入1%壳聚糖醋酸水溶液4 ml后絮凝效果最好。

图2 加入壳聚糖絮凝剂后对OD值的影响

2.1.3 最佳絮凝时间的测定

取6等份（每份为50 ml）废水调节pH值为4.0，加入1%壳聚糖醋酸水溶液4 ml，搅拌2 min，然后分别絮凝0.5、1、2、3、4 h和5 h,抽滤，抽滤液在730 nm处下测OD值。结果见图3，静置时间3 h絮凝效果最好。

图3 絮凝时间对OD值的影响

2.2 絮凝工艺条件的优化

根据试验2.1，以调节废水pH值、每升废水中加入1%壳聚糖醋酸水溶液体积和絮凝时间为影响因素，以布氏漏斗双层滤纸抽滤液在730 nm处下测定的OD值为指标，进行正交试验，因素水平见表1，试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验结果与分析

由表2可以看出，R1＞R2＞R3，各因素影响次序为：pH值＞每升废水中加入1%壳聚糖醋酸水溶液体积＞絮凝时间，最优组合为A2B2C1，即调节pH值为4.0、1%壳聚糖醋酸水溶液絮凝加入量为80 ml/l、絮凝时间为2 h。

根据上述正交试验结论，调节pH值为4.0、每升废水中加入1%壳聚糖乙酸水溶液80 ml、絮凝时间2 h，进行验证试验，结果抽滤液中吸收光度达0.081 60，废水絮凝效果最好。用微量凯氏定氮法测定废水原液与絮凝物蛋白含量，蛋白质的回收率为88.6%。

2.3 蛋白酶水解与虾青素的提取

2.3.1 蛋白酶水解絮凝物对水解度的影响

以优化后的絮凝工艺条件，絮凝废水中的虾青素与蛋白质，试验中研究了4种蛋白酶（风味酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶）水解工艺条件，在初始pH值6.5，水解温度55℃下，按固液比为1∶1.5加水，酶的添加量均为1.5 g/kg絮凝物，酶解一定时间。试验结果如图4所示。

图4 蛋白酶水解絮凝物对水解度的影响

从图4中可以看出，风味酶（Flavourzyme）的水解效果最好，风味酶是一种内切酶和外切酶的复合物，能高度水解蛋白质，产生的肽和氨基酸能赋予产品更多的香味和更饱满的风味。

2.3.2 风味酶用量对虾青素提取率的影响

图5 风味酶用量对虾青素提取率的影响

根据风味酶适宜在50～60℃、pH值6.0～6.5的条件下反应，在初始pH值6.5、温度55℃下，以固液比为1∶1.5加水，分别按照每千克絮凝物添加0.6、0.9、1.2、1.5、1.8和2.1 g酶的比例添加风味酶，蛋白酶保温酶解时间6 h，测定虾青素提取率，试验结果如图5所示。

从图5可以看出，随着风味酶用量的增加，蛋白底物的水解度明显加大,当酶的添加量达到1.5 g/kg絮凝物时，水解度的增加逐渐缓慢下来，综合考虑蛋白酶的使用成本和生产工艺需要，蛋白酶的添加量为1.5 g/kg。

2.3.3 酶解时间对虾青素提取率的影响

按照1.5 g/kg絮凝物的比例添加风味蛋白酶，在初始pH值6.5、温度55℃下，分别保温酶解2、3、4、5、6和7 h，测定虾青素提取率，试验结果如图6所示。

图6 酶解时间对虾青素提取率的影响

从图6中可以看出，随着酶解时间的延长，虾青素的提取率逐步增大,当酶解时间超过4 h后，虾青素的提取率逐步降低，这可能是因为随着反应时间的延长，蛋白酶会对虾青素产生破坏作用。酶解时间定为4 h。

2.3.4 固液比对虾青素提取率的影响

图7 固液比对虾青素提取率的影响

综合上述试验结果，对絮凝物加水，采用1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3的固液比，在初始pH值6.5、温度55℃下，选用风味酶1.5 g/kg絮凝物，保温酶解时间4 h，测定虾青素提取率，结果如图7所示。

从图7可以看出，在固液比达到1∶2时，虾青素提取率可达4.49%。该条件下蛋白质的水解度为23.8%。将提取虾青素后的蛋白质浓缩，喷雾干燥，制成蛋白制品，产品不苦，有较好的风味。

3 结果与讨论

3.1 以小龙虾壳为原料，按酸碱交替法生产甲壳素，蛋白质和虾青素等物质流失于废水中，采用天然、无毒、无味的壳聚糖作絮凝剂，可将虾青素与蛋白质絮凝沉淀。试验表明：调节pH值4.0，每升废水中添加80 ml 1%壳聚糖乙酸水溶液，静置2 h，废水中溶液的透光率最低，絮凝物蛋白质回收率达88.6%。

3.2 以壳聚糖在最佳条件下絮凝小龙虾壳酸碱交替法制备甲壳素产生的废水，比较了几种蛋白酶水解絮凝物的蛋白质水解度，其中风味蛋白酶的水解度最高。采用风味蛋白酶酶解壳聚糖絮凝物，用二氯甲烷为萃取剂，重复萃取多次至上清液无色，真空水浴加热回收二氯甲烷，再用乙醇溶解沉淀物，用盐酸调节pH值沉降虾青素，真空干燥，测定虾青素的质量，计算虾青素的提取率。试验表明：在初始pH值6.5，温度55℃下，选用风味酶1.5 g/kg絮凝物，固液比1∶2时，保温酶解时间4 h，虾青素提取率可达4.49%。该条件下，蛋白质的水解度为23.8%。熊汉国等[10]以乙醇为溶剂，以乙醇浓度95%、温度70℃、0.5 h，龙虾中虾青素提取率可达4.92%。本工艺从小龙虾壳加工甲壳素废水中提取虾青素，提取率偏低，仍有极少部分虾青素流失。

3.3 用风味蛋白酶对小龙虾壳加工过程中的副产品蛋白质进行水解，提取虾青素并将水解后蛋白质浓缩，喷雾干燥，制成水解动物蛋白，产品没有因水解度不合适而产生苦味的的问题，具有良好的风味。

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