虾壳在1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体中的溶解特性

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(1.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088; 2.水产品深加工广东省普通高校重点实验室,广东湛江 524088; 3.广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江 524088)

甲壳素是自然界第二大丰富的天然聚合物,含量仅次于纤维素。甲壳素经脱乙酰反应可制备乙酰度不同的壳聚糖。因具有良好的生物相容性、吸附性和安全性,甲壳素和壳聚糖被广泛用于伤口敷料[1]、药物释放[2]以及污水处理等[3]。虾壳中的甲壳素含量一般为14%～25%,是制备甲壳素的主要原料[4]。在工业生产中,通常采用酸碱法去除虾壳中的矿物质和蛋白质以提取甲壳素[5]。该方法不仅对环境造成严重威胁,而且使甲壳素脱乙酰,导致分子量降低[6-7]。近年来,微生物发酵法和酶法提取甲壳素因条件温和、环境友好等优点日益受到关注。但是,提取工艺耗时长、残余蛋白质较多等缺点限制了其工业化应用[8]。

离子液体具有良好的溶解性能、热稳定性、可循环利用和可设计性等显著优点[9]。1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([C2mim]Ac)对纤维素、甲壳素和淀粉等多糖具有突出的溶解能力,再生后材料中残余的离子液体可通过水或乙醇彻底除去,因此[C2mim]Ac可作为食品材料的加工助剂[10-12]。2017年,Husson等[13]首次采用[C2mim]Ac预处理甲壳素提高其酶水解能力。目前,有关天然聚合物虾壳与离子液体相互作用的报道十分有限。Qin等[14]以[C2mim]Ac为虾壳溶剂制备了甲壳素膜及甲壳素纤维,为甲壳素的绿色提取工艺提供了新的研究方向。

本文以[C2mim]Ac为虾壳溶剂,从溶解度、回收率、组分、表观形貌和晶体结构等方面系统探索了溶解时间、溶解温度、固-液比对虾壳在[C2mim]Ac中溶解行为的影响规律。研究可为对虾加工下脚料的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜的凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)壳 广东省国联水产股份有限公司;[C2mim]Ac(纯度>95%) 中国科学院兰州化学物理研究所;其他试剂 均为分析纯,上海阿拉丁试剂公司。

DF-101型集热式磁力搅拌器 巩义予华仪器有限责任公司;DMI4000B倒置荧光显微镜 德国徕卡显微系统;卤素快速水分测定仪 瑞士Mettle-Toledo公司;全自动凯氏定氮仪 德国Gerhardt公司;D8 X-衍射仪 德国Bruker公司;S-4800扫描电镜仪 日本Hitachi公司。

1.2 实验方法

1.2.1 虾壳样品组分的测定 将虾壳洗净,在电热鼓风干燥箱内50 ℃干燥28 h,用高速粉碎机粉碎,过120目筛,在-18 ℃下保存,备用[15]。根据文献[8]分别在105和550 ℃下测定虾壳样品中的水分和灰分含量。采用凯氏定氮法测定总氮,粗蛋白质的含量在总氮基础上乘以系数6.25[16]。采用索氏提取法以己烷做溶剂测定脂类含量[8]。

1.2.2 虾壳的溶解与再生 在圆底烧瓶中准确称取10 g[C2mim]Ac,在恒温磁力搅拌器中加热到指定温度,按一定固-液比向其中加入虾壳粉,在显微镜下观察溶解过程,一定时间后结束反应。向烧瓶中加入30 mL蒸馏水趁热离心分离(8000 r/min,10 min),将沉淀洗涤多次后在45 ℃下干燥48 h,所得固体粉末即为再生后的虾壳材料,称重,所得质量与初始样品质量之比即为虾壳回收率。将第一次离心后的上清液冷却至室温,补充30 mL蒸馏水,在转速为8000 r/min下离心分离沉淀物10 min,洗涤多次,45 ℃下烘干48 h、称重。沉淀物干燥后的质量与初始虾壳质量之比即为溶解率[17],再生后虾壳中蛋白质的去除率采用公式(1)计算:

蛋白质去除率(%)=(原虾壳中蛋白质总量-再生后虾壳中蛋白质总量)/原虾壳中蛋白质总量×100

式(1)

1.2.3 单因素实验 单因素实验设计如下:固液比为1∶20 (w/w),溶解温度为120 ℃,设置不同溶解时间(0、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 h);固液比为1∶20 w/w,溶解时间为1 h,设置不同溶解温度(60、80、100、120和140 ℃);溶解温度为120 ℃,溶解时间为1 h,设置不同固-液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25，w/w)。系统考察了不同条件处理虾壳后,虾壳溶解度、化学组分、晶体结构和表观形貌的变化。

1.2.4 虾壳样品表面形貌观察 未处理的虾壳粉末和溶解再生后的固体样品粉末经过喷金处理,厚度为20 nm,采用扫描电镜(SEM)在电压为20.0 kV下观察样品表观形貌。

1.2.5 虾壳样品晶体结构分析 采用X-射线衍射(XRD)测定未处理的虾壳以及溶解再生后虾壳的晶体结构。测试条件为:Cu靶Kα射线,2θ范围5～60 °。根据公式(2)计算溶解前后样品的结晶度指数(CrI)[18]:

式(2)

其中,Iam和I110分别为2θ=16 °和2θ=20 °的衍射峰反射强度。

1.3 数据处理

所有实验平行测定三次,计算平均值和标准差。采用SPSS软件对数据进行显著性分析,Excel软件回归拟合实验数据,Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 虾壳在[C2mim]Ac中的溶解及回收

甲壳素是N-乙酰基-D-葡糖胺通过β-(1,4)甙键联结的支链多糖,羟基、氨基、羰基使其分子内部和分子之间存在强烈氢键作用,所以甲壳素难溶于水和普通溶剂[19]。研究证明,咪唑类离子液体具有溶解甲壳素的良好能力[20-21]。根据文献[22],110 ℃下甲壳素在1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([C4mim]Cl)中的溶解度为10%。溶解前虾壳的基本成分测定结果见表1。虾壳中甲壳素含量为28.67%,这与文献[4]报道相符。然而,虾壳中含有的蛋白质(42.90%)与甲壳素紧密结合,矿物质(22.43%)附着于纤维表面,因此虾壳在离子液体中的溶解情况更为复杂。

表1 虾壳粉(干基)主要成分的含量Table 1 Content of main components of shrimp shells powder(dry basis)

Al-Sawalmih等[23]研究指出，美国龙虾(Homarusamericanus)壳的结构是多层次的。从图1观察到凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)壳在溶解前呈现不规则多边形状和类似的多层微观结构。前期研究发现木质纤维素或淀粉在[C2mim]Ac中被加热,颗粒体积不断增加,发生溶胀,然后溶解[11,24]。不同的是,虾壳粉颗粒并未溶胀,而是不断消融和分解。

图1 不同条件下[C2mim]Ac溶解虾壳的显微照片Fig.1 Micrographs of shrimp shells dissolving in[C2mim]Ac at different conditions注：a:未处理;b:1∶20 w/w,120 ℃,0.5h;c:1∶20 w/w,120 ℃,4 h;d:1∶20 w/w,60 ℃,1 h;e:1∶20 w/w,100 ℃,1 h; f:1∶20 w/w,140 ℃,1 h;g:1∶5 w/w,120 ℃,1 h;h:1∶15 w/w,120 ℃，1 h;i:1∶25 w/w,120 ℃,1 h。图5同。

当固-液比为1∶20 (w/w)时,在120 ℃下加热0.5 h后,[C2mim]Ac中出现许多纤细的丝状甲壳素纤维,4 h后几乎观察不到形状完整的虾壳颗粒,而且丝状纤维也明显减少。文献指出虾壳在1-烯丙基-3甲基-咪唑氯盐([Amim]Cl)中137 ℃下加热40 min后的溶解度最大为1.57%[17]。由表2可知,120 ℃下凡纳滨对虾壳在[C2mim]Ac中的溶解度随时间的增加而增大(0.5～1 h),1 h后溶解度为12.29%,此后随时间的延长,溶解度急剧下降,溶解8 h后,溶解度仅为1.63%。

表2 溶解时间对虾壳溶解度、回收率和结晶度指数的影响Table 2 Effects of dissolution time on the solubility,recovery of shrimp shells and CrI

虾壳在[C2mim]Ac中的溶解也明显受到温度的影响。如图1所示,当固-液比为1∶20 (w/w)时,虾壳粉颗粒在60 ℃下加热1 h后部分溶解、断裂,产生出少量且细小的甲壳素纤维;在100 ℃下加热1 h,块状颗粒几乎全部断裂分离出更多丝状的甲壳素纤维;温度升高到140 ℃后,反而有大量未溶解或者未分解的大粒径块状虾壳粉颗粒。由表3可知,当温度从60 ℃升高到140 ℃时,虾壳在[C2mim]Ac中的溶解度呈现先增加后减小的趋势。温度为100 ℃时,溶解度达到15.34%,而140 ℃下的溶解度仅为2.35%。此外,随着[C2mim]Ac含量的增加,虾壳的溶解度不断增大,当固-液比达到1∶20 (w/w)后,溶解度没有明显的增加(表4)。在相同的处理条件下,显微镜下观察到的虾壳在[C2mim]Ac中的溶解过程基本上与实验测定的溶解度变化趋势一致。

表3 溶解温度对虾壳溶解度、回收率和结晶度指数的影响Table 3 Effects of dissolution temperature on the solubility,recovery of shrimp shells and CrI

表4 固-液比对虾壳溶解度、回收率和结晶度指数的影响Table 4 Effects of solid-solvent ratio on the solubility, recovery of shrimp shells and CrI

周雅文等[17]研究指出,离子液体主要溶解和再生的物质是虾壳中的甲壳素。由表2～表4可知,再生虾壳固体的回收率随溶解时间的增加、溶解温度的升高或离子液体含量的增加而下降。该结果表明,延长加热时间、高温或增加溶剂含量均利于虾壳中主要成分的溶解,因此再生后固体回收率更低。尤其当固-液比为1∶20 (w/w)时,在120 ℃下溶解8 h或140 ℃下溶解1 h后,虾壳固体回收率分别仅为42.77%和43.61%。由此推测,尽管虾壳中的甲壳素能够在一定条件下溶解于[C2mim]Ac,但是高温和长时间的加热可能会促使部分甲壳素降解为易溶于水的小分子,不仅导致已经溶解的甲壳素含量减少,而且体系黏度的增加不利于甲壳素在[C2mim]Ac中的进一步溶解。此外,虾壳中的其他重要成分如矿物质和蛋白质可能与[C2mim]Ac发生相互作用,从而影响甲壳素的溶解。

2.2 [C2mim]Ac溶解处理后虾壳组分的变化

离子液体及含离子液体的多元体系具有溶解并提取蛋白质的能力[25-26],而虾壳中的灰分含量是影响甲壳素溶解能力的重要因素[27]。因此,根据表2～表4所列的条件处理虾壳,对比分析了未处理和不同条件处理后虾壳样品的组分变化情况。如图2～图4所示,与虾壳原料相比,[C2mim]Ac处理后的样品中蛋白质含量降低,而且随着溶解时间的增加、溶解温度的升高或离子液体含量的增加而下降。当固-液比为1∶20 (w/w),溶解温度120 ℃,溶解时间8 h,再生后虾壳样品中蛋白质含量仅为14.1%,此时蛋白质脱除率达到67.13%。结果表明,[C2mim]Ac能够破坏虾壳中甲壳素与蛋白质的结合,导致蛋白质的部分溶解。同时,蛋白质在高温下分解产生小分子物质如氨基酸等,增加体系黏度并降低[C2mim]Ac对甲壳素的溶解能力。

图2 溶解时间对再生虾壳成分的影响Fig.2 Effect of dissolution time on the composition of regenerated shrimp shells

图3 溶解温度对再生虾壳成分的影响Fig.3 Effect of dissolution temperature on the composition of regenerated shrimp shells

图4 固液比对再生虾壳成分的影响Fig.4 Effect of solid-solvent ratio on the composition of regenerated shrimp shells

不仅如此,[C2mim]Ac处理后的样品中灰分含量随溶解条件呈现不同程度的降低。当固-液比为1∶20 (w/w),溶解温度100 ℃,溶解时间1 h,再生后虾壳样品中灰分含量仅为12.82%,此时矿物质脱除率达到42.84%。结果表明，[C2mim]Ac具有脱除虾壳中矿物质的能力,但是过高的温度(>120 ℃)和长时间(>2 h)加热不利于矿物质的溶解和脱除,而固-液比的影响并不明显。

2.3 [C2mim]Ac溶解处理后虾壳的表观形貌

从图5可以看出,未处理的虾壳具有表面光滑且致密的多层结构,而经过[C2mim]Ac溶解处理后的虾壳样品多粗糙不平。对所有样品进行仔细观察对比后,发现经过[C2mim]Ac溶解处理后的虾壳样品大致呈现4种表观形貌特征:鱼鳞状且表面多孔,如固-液比为1∶20 (w/w)在60 ℃下溶解1 h的样品;多层结构扭曲变形,分离产生单层结构,如固-液比为1∶25 (w/w)在120 ℃下溶解1 h的样品;表面出现粘附的丝状纤维,如固-液比为1∶20 (w/w)在120 ℃下溶解0.5 h的样品;表面分布许多晶体状颗粒,如固-液比为1∶20 (w/w)在120 ℃下溶解4 h的样品。

图5 [C2mim]Ac溶解处理前后虾壳扫描电镜图(5000×)Fig.5 SEM of untreated shrimp shells and the samples treated by[C2mim]Ac(5000×)

Kaya等[28-29]从其他原料中提取的甲壳素也有类似的鱼鳞状、多孔或丝状纤维结构,并指出矿物质的去除是导致甲壳素材料表面形成微孔或纳米孔的主要原因。据此推测,由于[C2mim]Ac溶解除去虾壳中的部分矿物质,材料表面形成许多随机分布的微孔。但是,高温和长时间处理使[C2mim]Ac中杂质增加,矿物质脱除能力下降,溶解后的矿物质聚集在甲壳素材料表面,从而形成粗糙的颗粒状表面形貌。

2.4 [C2mim]Ac溶解处理后虾壳的晶体结构

如图6所示,未处理虾壳和[C2mim]Ac溶解处理后样品在2θ=9.0 °和2θ=19.4 °处都有显著的衍射峰,这分别是葡萄糖胺序列和N-乙酰-D-葡萄糖胺单体的特征衍射峰[30],说明所有虾壳样品都具有斜方晶相的微晶结构[31-32]。然而,[C2mim]Ac处理后的样品在2θ=19.4 °处衍射峰明显减弱。

图6 [C2mim]Ac溶解处理前后虾壳XRD图Fig.6 XRD patterns of untreated shrimp shells and the samples treated by[C2mim]Ac

根据结晶区和无定形区分布情况,由公式(1)计算得到未处理虾壳的CrI为78.4%,[C2mim]Ac处理后样品的CrI均有不同程度的下降,结果见表2～表4。固-液比为1∶20 (w/w)在80 ℃下处理1 h后回收样品的CrI下降到58.7%。结果表明,[C2mim]Ac溶解处理破坏了虾壳中甲壳素的结晶结构,而且矿物质的脱除利于降低虾壳样品的结晶度。

3 结论

本文以[C2mim]Ac为凡纳滨对虾壳溶剂,探索了溶解时间、溶解温度、固-液比3个因素对虾壳溶解度、回收率、组分、表观形貌、晶体结构等方面的影响规律。结果表明,虾壳在[C2mim]Ac的作用下分解出细小的甲壳素纤维,在一定范围内升高温度、延长溶解时间或增加离子液体含量均利于虾壳的溶解。当固-液比为1∶20 (w/w),100 ℃下加热1 h后,溶解度达到15.30%。[C2mim]Ac还具有溶解蛋白质和矿物质的能力。但是,当温度超过120 ℃,溶解时间超过2 h不利于[C2mim]Ac对虾壳中矿物质、蛋白质和甲壳素的溶解。与未处理的虾壳相比,[C2mim]Ac溶解处理后的样品表面多孔、粗糙或扭曲变形,而且结晶结构被破坏。研究结果为进一步探索从天然生物资源中采用离子液体替代传统酸碱法提取甲壳素提供了理论依据。