卵黄高磷蛋白对壳聚糖膜基质上MC3T3-E1细胞增殖的影响

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(华中农业大学食品科技学院,蛋品加工技术国家地方联合工程研究中心,湖北武汉 430070)

禽蛋是人们获取营养的重要来源之一,其中富含多种多样的功能性蛋白。卵黄高磷蛋白(posvitin,PV)就是从禽蛋中提取的磷酸化程度最高的糖蛋白,它占禽蛋总蛋白的7%,含有的磷元素却高达10%[1-3]。据报道,PV中丝氨酸占所有氨基酸的30%～50%,其磷酸化程度高达90%[4-6]。这种独特的高磷酸化结构使该蛋白在鸡胚的骨骼发育中发挥了重要作用[7]。体外研究表明，PV还具有很强的金属离子结合能力[8]和抗氧化活性[9]等功能。目前国内外对PV的研究主要集中在卵黄高磷蛋白乳化性及抗氧化活性、酶解多肽的提取[10]多肽对金属离子的结合[11]等方面。实验室前期一系列研究结果发现,PV具有调控、诱导Ca2+体外矿化的功能,为PV作为一种骨骼发育营养助剂的高值化应用提供了新方向[12]。目前,关于卵黄高磷蛋白对成骨细胞的增殖分化的影响的报道多集中于细胞增殖和诱导分化[13]。而以生物大分子作载体,研究卵黄高磷蛋白对成骨细胞增殖分化还处于起步阶段。

近年来,由于大众环保和安全意识的提升,研究者们将更多的目光集中在生物高分子材料上,利用它们安全、无毒、易降解的性质做成各种复合膜应用于食品包装和医学、生物等方面[14],比如经过脱乙酰过程加工后的甲壳素产物──壳聚糖(Chitosan,CS)。壳聚糖是由β-(1,4)-2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖构成线性,而且是自然界中目前发现的唯一碱性多糖[15-18]。CS本身是一种弱阳离子絮凝剂,因此常用作食品加工中的果汁澄清剂、糖汁絮凝剂[19];此外,CS还可以作为膳食纤维应用于食品添加剂中调节人体免疫[20]。CS有很强的成膜能力且安全无毒,因此壳聚糖在食品包装方面应用普遍[21]。据研究报道,神经干细胞在CS膜上经过短期培养,其贴附效果比在明胶和PLGA膜上更好[22]。表明CS作为新型负载基质,在细胞水平上也表现出很好的生物相容性。

本次研究拟制备氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)复合CS膜,以提高CS膜的抗水溶性和负载量。通过检测MC3T3-E1细胞的细胞活性、细胞凋亡和细胞周期的变化,探讨MC3T3-E1细胞在该复合膜上的生理活动,从而研究不同浓度PV对MC3T3-E1细胞的细胞活性和细胞凋亡的影响。以期为后续为进一步发展PV成为一种促进人体骨骼发育的新型材料和营养强化剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鸡蛋 武汉九峰山养鸡场;小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1) 中国科学院上海细胞库;胎牛血清、0.25%胰酶EDTA 澳洲GIBCO公司;α-MEM培养基 美国HyClone公司;抗坏血酸 美国SIGMA公司;β-甘油磷酸钠 阿拉丁公司;CCK-8试剂盒、Annexin V/PI试剂盒 北京庄盟国际生物基因科技有限公司;细胞周期检测试剂盒 南京凯基生物；1-(3-甲基氨基醛)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHs) 国药集团化学试剂有限公司。

HERAcell 1501二氧化碳培养箱 德国Thermo Scientific 公司;IX71荧光倒置显微镜 日本Olympus公司;iMark酶标仪 联想生物科技有限公司;FACSCalibur流式细胞仪 美国BD公司;TDL-50B台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂;FACSCalibur流式细胞仪 美国BD公司;Option S7超纯水系统 ELGA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 卵黄高磷蛋白的分离纯化 参照张晓维[12]的方法提取卵黄高磷蛋白。用分蛋器分离鸡蛋清和蛋黄,随后将蛋黄放在滤纸上,翻滚来去掉多余的系带和蛋清,用竹签刺破蛋黄膜,用冰水浴中的烧杯将流出的蛋黄液收集起来。加入与蛋黄液同等质量的蒸馏水混合,用磁力搅拌器搅拌1 h后,再用12000×g离心力离心10 min,随后收集下层沉淀。再然后用同等质量的0.17 mol/L的NaCl溶液与下层沉淀混合搅拌1 h再在12000×g下离心10 min,这样使蛋黄颗粒(下层沉淀)与蛋黄浆质(上清)分离,收集目标物蛋黄颗粒沉淀。用10倍质量体积比(g/mL)的1.74 mol/L NaCl溶液和蛋黄颗粒沉淀搅拌混匀,再将溶液的pH调至4.0,加入聚乙二醇(PEG 6000)使其最终的质量比达到3%,搅拌1 h后1200×g下离心10 min获得上清液。上清液经过8000～14000 kDa的透析袋透析后，再次12000×g下离心10 min,收集上清液进行冷冻干燥,即可获得粗提卵黄高磷蛋白。粗提卵黄高磷蛋白经过弱阴离子交换柱得到不含二或三价金属离子的卵黄高磷蛋白[12]。对层析后的蛋白透析后冷冻干燥即得到不含多价金属离子和盐的卵黄高磷蛋白。

1.2.2 卵黄高磷蛋白的纯度鉴定 本研究采用的是SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒进行。选用12%浓度的分离胶和5%浓度的浓缩胶。固体样品用蒸馏水溶解后配制为2 mg/mL的溶液,从中取40 μL蛋白样液,与10 μL的5×蛋白上样缓冲液混匀,水浴煮沸4 min,上样量为10 μL。分离胶电压为120 V,浓缩胶电压为80 V。预染色蛋白质Marker分子量范围为10～170 kDa。电泳完成后,电泳凝胶先在固定液中固定40 min;然后转移至磷蛋白染色液1中,在45 ℃水浴摇床中染色40 min;接着转移至磷蛋白染色液2中,在相同温度下继续染色40 min。最后将凝胶浸泡在脱色液中进行脱色,每隔一段时间更换脱色液至背景颜色变为无色为止。最后用凝胶成像仪拍摄电泳结果。

1.2.3 MC3T3-E1细胞的培养及CS和GO/CS膜的制备 迅速解冻冻存的MC3T3-E1细胞,随后将细胞转移到1.5 mL的离心管中在1200×g下离心2 min后倒上清,再加入适量培养基小心吹打均匀。随后将细胞悬浊液转移到细胞培养板上,补充培养液保证每孔溶液约3.5 mL左右进行培养。当细胞数量铺满培养板面积的85%～95%左右进行传代培养。小鼠成骨细胞传代时,先用适量灭菌Hanks缓冲液清洗细胞2～3次,随后用1 mL胰酶消化80 s左右,随后加入2×胰酶溶液体积的细胞培养液,轻轻吹打几下后将细胞混合溶液转移到离心管中,1200×g下离心2 min。倒上清,加入新的培养液后小心吹打均匀,随后分装到新的细胞培养板上。MC3T3-E1细胞用α-MEM完全培养液(含10%胎牛血清、100 U/mg青霉素和100 μg/mL链霉素)在37 ℃,5% CO2和湿度为90%的培养箱中培养。

制备CS及GO/CS膜:取1 g CS溶解于100 mL浓度为2%(v/v)的醋酸溶液中,在50 ℃下搅拌2 h溶解,室温下静置除去溶液中的气泡。取适量的1 mg/mL的GO溶液,分别加入EDC和NHS使之最后的浓度为0.03、0.06 mol/L用以活化羧基,搅拌混匀后用1 mol/L的NaOH溶液调节pH=7.0。将GO溶液和CS溶液混合使二者的质量比分别为0∶100、0.5∶100、1∶100和2∶100,即CS膜、0.5% GO/CS膜、1% GO/CS膜和2% GO/CS膜。随后溶液超声4 h后备用。将上述溶液分别倒入6孔(1 mL)或是96孔(100 μL)细胞培养板中,50 ℃下晾干。之后用1 mol/L NaOH溶液浸泡CS膜15 min,之后用超纯水冲洗3次,再次烘干。使用之前用紫外灭菌30 min。

1.2.4 CS及其复合膜对细胞活性影响 本实验采用CCK-8试剂盒测定细胞活性的影响。取对数生长期的MC3T3-E1细胞1×105个/mL的细胞悬浊液150 μL放入含有膜的96孔培养板中,放置在培养箱中培育24 h,培养箱的环境为37 ℃,5% CO2,湿度90%。24 h后弃掉原培养液,再向每孔加入135 μLα-MEM完全培养液+15 μL CCK-8溶液在37 ℃下培育2 h,之后在450 nm波长处用酶标仪检测OD值。每组设置6组重复,此试验重复3次。空白组为不加细胞，但是加入135 μL培养液+15 μL CCK-8。

1.2.5 CS及其复合膜对细胞凋亡的影响 采用Annexin V/PI试剂盒检测。细胞以1×106个/孔接种于上述制备的6孔板上,细胞培养板分为空白组、CS膜、0.5% GO/CS膜、1% GO/CS膜和2% GO/CS膜5组。细胞培育24 h后,用含EDTA的胰酶消化后1200×g离心5 min去上清,用PBS缓冲液重悬,离心去上清,再用PBS缓冲液重悬离心去上清,并且保证每个试验样品的细胞数不少于1×106个。然后加入500 μL的细胞上样液,5 μL的膜联蛋白-V(Annexin V)和10 μL的碘化丙啶(PI),混合均匀。室温避光反应15 min,为保证实验效果样品要在1 h内进行流式细胞仪检测。

1.2.6 CS及其复合膜对细胞周期的影响 具体过程:取对数生长期的细胞接种在空白组和CS薄膜的6孔培养板上,细胞的浓度为2×106个/孔;培养24 h后,细胞总数不少于1×106个/孔,用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞,终止消化后收集细胞,在1200×g离心5 min后去上清,PBS重悬润洗细胞沉淀1次;1000×g离心5 min,去上清,100 μL PBS重悬细胞,将700 μL预冷的80%乙醇缓慢加入,使乙醇终浓度为70%;4 ℃固定4 h以上;1000×g离心5 min,预冷PBS润洗2次,随后加入100 μL RNase(50 μg/mL),37 ℃水浴30 min;加入400 μL PI,4 ℃避光染色30 min;流式细胞仪检测PI荧光强度。用Cotfit软件分析G1期、S期、G2期细胞数,计算细胞各周期所占的比例。

增殖指数PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2M)×100

1.2.7 卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞增殖的影响 为研究不同浓度卵黄高磷蛋白对细胞影响和磷蛋白与CS膜共同作用细胞的影响,实验分为两大组:空白组和CS膜组。在每组中,细胞α-MEM培养液中分别加入0、100、200和500 μg/mL PV进行研究。采用CCK-8试剂盒进行检测。取对数生长期的MC3T3-E1细胞1×104个/mL的细胞悬浊液150 μL接种到底部有CS膜和没CS膜的96孔培养板中。待细胞贴壁后,加入含有不同PV浓度的培养基培养24 h,随后尽量吸走上清液,并加入150 μL含有10% CCK-8溶液的培养基。培育2 h后用酶标仪在450 nm波长处测OD值。

1.2.8 卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞凋亡的影响 实验分为两大组:空白组和CS膜组。在每组中,细胞α-MEM培养液中分别加入0、100、200和500 μg/mL PV进行研究。取对数生长期的MC3T3-E1细胞1×106个/mL的细胞悬浊液1 mL接种到底部有CS膜和没有CS膜的6孔培养板中。待细胞贴壁后,加入含有不同PV浓度的培养基培养24 h。后续过程同1.2.5。

1.3 数据处理

细胞增殖结果均用Origin 8.0作图,用SPSS统计软件进行t检验和方差分析,用Flowjo软件对流式细胞仪结果进行分析及作图,用Cotfit软件分析细胞周期数量。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE凝胶电泳分析

卵黄高磷蛋白是一种高度磷酸化的糖蛋白,目前来自鸡蛋的卵黄高磷蛋白主要分为α-PV和β-PV。其中,α-PV含有3～4个亚基,分子量为35～40 kDa,而β-PV含有4～5个亚基,主要分子量为45 kDa。图1表明,卵黄高磷蛋白主要条带在35 kDa左右,制备的PV主要条带和Sigma标品的条带一致。因此,可以用此蛋白进行后续研究。

图1 Sigma标准品与提取的卵黄高磷蛋白SDS-PAGE电泳图谱Fig.1 SDS-PAGE patterns of purified phosvitin from egg yolk compared with Sigma standard phosvitin

2.2 CS及其复合膜对MC3T3-E1细胞活性的影响

CCK-8试剂盒是一种间接测量细胞活性的方法。从图2可见,与空白对照组(组织培养聚苯乙烯板)相比,CS膜能够极显著促进MC3T3-E1细胞增殖活性(p<0.01),提高了31.92%。GO/CS膜则都降低了细胞活性,GO含量越多,细胞活性下降越明显,GO含量为2%时,细胞活性下降了83.9%。这说明GO对MC3T3-E1细胞增殖有抑制作用,并且呈现剂量依赖性。之前有研究表明，CS具有良好的生物相容性,对SD胎鼠颅骨成骨细胞[23]与间充质干细胞[24]无毒性作用。有学者证实了碳基纳米材料对不同的细胞有不同的毒害作用[25],此结果同样说明了GO对MC3T3-E1细胞有毒害作用。

图2 CS及GO/CS膜对细胞活性影响Fig.2 Effects of chitosan and graphene oxide/chitosan membrane on cell viability注:不同小写字母表示差异极显著(p<0.01);图4、图6、图7、图9同。

2.3 CS膜及GO/CS膜对MC3T3-E1细胞凋亡的影响

利用流式细胞仪检测MC3T3-E1细胞在CS及GO/CS复合膜上培育24 h后细胞状态的具体情况如图3。对图3中正在凋亡和已经凋亡的细胞占比总结得图4,分析结果发现:CS膜组的凋亡率相比空白组显著下降了45.78%;但是随着GO的加入,MC3T3-E1细胞凋亡率呈现上升的趋势,GO含量到2%时,凋亡率到达了17.64%。这个结果说明，CS能够降低细胞的凋亡过程,而GO却对细胞产生毒害作用,加剧了细胞凋亡。此结果与上面的细胞活性实验结果相吻合。

图3 CS及GO/CS膜对MC3T3-E1细胞凋亡分布影响Fig.3 Effect of chitosan and its graphene oxide composite membrane on the apoptosis of MC3T3-E1 cells

图4 CS及GO/CS膜对MC3T3-E1细胞总凋亡的统计Fig.4 Statistics of total apoptosis of MC3T3-E1 cells by chitosan and graphene oxide/chitosan membrane

2.4 CS膜对MC3T3-E1细胞周期的影响

细胞周期是说从一次细胞分裂结束开始到下一次细胞分裂结束为止的过程。一般来说细胞周期分为:G0期、G1期、S期、G2期和M期。用流式细胞仪检测培养后的细胞各个周期的比例,如图5。由于检测过程中G0期和G1期的DNA数量相同,流式细胞仪不能区分两者各自的检测值,因此显示为一个指标,标记为G0/G1。同样,G2和M也整合成一个指标,标记为G2/M。在细胞整个分裂过程中,S期是指从DNA合成开始到结束的过程,在细胞分裂过程中起至关重要的作用。如图6所示,空白组的细胞周期分布为:G0/G1期为69.6%,S期为21.42%,G2/M期为8.98%;在CS膜上培育的细胞周期分布则是:G0/G1期为60.84%,S期为30.63%,G2/M期为8.53%。相比于空白组,CS膜组的G0/G1期细胞比例下降12.59%,S期细胞比例上升了43.00%。此结果说明,CS膜对MC3T3-E1细胞增殖具有促进作用,这与前面细胞活性实验结果吻合。

图5 CS膜上MC3T3-E1各个细胞周期分布Fig.5 Distribution of the cell cycle of MC3T3-E1 on the chitosan membrane

图6 CS对MC3T3-E1细胞对各个细胞周期所占的百分比的影响Fig.6 Effect of chitosan on the percentage of MC3T3-E1 cells in each cell cycle

2.5 卵黄高磷蛋白对培养在CS膜上MC3T3-E1细胞增殖的影响

卵黄高磷蛋白是一种高度磷酸化的糖蛋白,与金属离子有很强的结合能力。据报道,体外培养的情况下,卵黄高磷蛋白对人牙髓细胞在10、100 ng/mL浓度下均能促进该细胞增殖,而在1 μg/mL的浓度下则产生抑制作用[26]。由于相同浓度的卵黄高磷蛋白对不同的细胞的影响效果不同,此次实验选择的浓度参考本实验室之前的研究结果[27]。根据图7可以看出,卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞增殖影响呈现先上升后下降的趋势。壳聚糖膜上，低浓度卵黄高磷蛋白(100 μg/mL)对细胞增殖促进作用最明显，为181.59%，上升81.59%；当蛋白浓度到达200 μg/mL时，和100 μg/mL蛋白浓度相比促进作用下降，但是与空白组(0 μg/mL蛋白浓度)相比，仍然显示出显著促进作用(p<0.05)；而蛋白浓度达到500 μg/mL则出现了对细胞增殖的抑制现象，细胞增殖仅为95.53%，下降了4.47%。空白组蛋白浓为500 μg/mL细胞增殖率最低，为61.36%。这说明卵黄高磷蛋白促进该细胞增殖的最佳浓度在100 μg/mL附近。综合Liu等[28]的研究,推测卵黄高磷蛋白促进细胞增殖可能是通过促进细胞分裂前期S期的细胞比例实现的。而CS对不含PV的组促进作用明显,在低、中浓度蛋白的情况下促进作用不明显,在高浓度蛋白下则产生了抑制的现象。

图7 不同PV浓度在不同基质上对细胞增殖的影响Fig.7 Effects of different concentrations of PV on cell proliferation in different substrates

2.6 卵黄高磷蛋白对培养在CS膜上MC3T3-E1细胞凋亡的影响

图8是卵黄高磷蛋白作用细胞24 h后经过Flowjo软件分析处理后的处在不同细胞时期的图像。分析图9发现,卵黄高磷蛋白对空白组和CS膜组产生的趋势是一致的。相比与不添加卵黄高磷蛋白组,添加了100、200 μg/mL卵黄高磷蛋白会显著抑制细胞凋亡(p<0.05);而当蛋白浓度达到500 μg/mL时,细胞凋亡所占比例显著增加(p<0.05)。

图8 CS膜上卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞凋亡的影响Fig.8 Eeffect of phosvitin on the apoptosis of MC3T3-E1 cells in chitosan membrane

图9 CS膜上卵黄高磷蛋白对MC3T3-E1细胞总凋亡的影响统计Fig.9 Statistics of effect of phosvition on total apoptosis of MC3T3-E1 cells on chitosan membrane

3 结论

壳聚糖能通过促使MC3T3-E1细胞进入分裂周期提高增殖活性,氧化石墨烯对细胞有毒性作用,呈现剂量依赖。因此,壳聚糖适合做MC3T3-E1细胞培养基质,氧化石墨烯则不适于该细胞后续研究。在壳聚糖基质上,卵黄高磷蛋白在100 μg/mL浓度时促进增殖和抑制凋亡的效果最明显,在500 μg/mL则开始出现抑制增殖和促进凋亡的效果。这可能与卵黄高磷蛋白的磷酸化有关。该结果为后续研究二者共同对MC3T3-E1细胞分化成成骨细胞后影响,为开发卵黄高磷蛋白的深层利用价值提供依据。