甲壳素酶的研究进展

徐田甜，侯是媛，齐斌，郑丽雪，季亚美，李政洪，王立梅*

1(常熟理工学院，苏州市食品生物技术重点实验室，发酵工程技术研究中心，江苏 常熟，215500) 2(苏州大学 医学部药学院，江苏 苏州，215123)

甲壳素又叫几丁质，是由β-1，4糖苷键连接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖高分子多聚体[1]，是自然界中唯一的天然带正电荷的多糖，每年自然界中储存量超过百亿吨，仅次于纤维素[2]。但甲壳素分子量极大，不溶于水，只溶于浓酸，这极大地限制了甲壳素的应用。目前降解甲壳素生成甲壳低聚糖的方法主要有化学法、物理法和酶法等。化学法主要有酸解法和氧化法，这2种方法反应条件比较严苛，反应产物不均一，产品稳定性差，对环境污染严重。物理法主要是利用微波、超声波等产生巨大能量使得β-1，4糖苷键等化学键大量断裂从而生成低分子量的甲壳低聚糖，其产品均一，稳定性好，对环境污染少[3]。VASILIEVA等[4]利用低温电子束等离子体(EBP)降解甲壳素，研究表明EBP对甲壳素的作用降低了其结晶度指数和聚合度。但物理方法生产成本比较高，应用于工业化生产可能性较低。酶法则是通过专一性或非专一性酶水解甲壳酶，非专一性酶包括纤维素酶、溶菌酶、脂肪酶等。甲壳素酶是降解甲壳素的专一性酶，能断裂甲壳素的β-1,4糖苷键使其水解生成N-乙酰葡糖胺[5-6]。与非专一性酶作用比较，专一性甲壳素酶酶解法反应温和，产品均一，对环境没有污染，大量节省生产成本和时间。因此，专一性甲壳素酶越来越受到人们的重视，本文主要对甲壳素酶的研究现状进行综述。

1 甲壳素酶的来源

能产生甲壳素酶的生物很多，包括微生物、动物、植物等。1905年，BENECKE首次发现几丁芽孢杆菌(Bacilluschitinovirous)能分解利用甲壳素[2]。1921年，FOLPMERS发现某些细菌和真菌能利用甲壳素在琼脂平板上形成水解圈，进而证明了甲壳素酶的存在[2]。1929年时，KARRER和HOFFMAN又在蜗牛体内发现了甲壳素酶[2]。之后，人们发现有一些病毒也能产甲壳素酶。

近年来，对产甲壳素酶的微生物研究越来越多。产甲壳素酶的微生物包括细菌、放线菌和真菌等，其中主要包括粘质沙雷氏菌、芽孢杆菌、假单胞菌以及链霉菌等[7-10]。LU等[11]从黄瓜根部分离到1株新型稀有放线菌SaccharothrixyanglingensisHhs.015，将甲壳素酶的基因片段在大肠杆菌中过表达，产生的可溶性蛋白Chi6769(77.9 kDa)对真菌苹果腐烂病菌(Valsamali03-8)有强烈的抑制作用。SONG等[12]在腐烂蘑菇的土壤里分离到1株新型的耐冷甲壳素酶生产菌Pedobactersp.,25 ℃下，其产生的甲壳素酶的酶活最高，该甲壳素酶对立枯丝核菌和灰葡萄孢菌的抑制率分别达到60.9%和57.5%，这种甲壳素酶PR-M6在低温下防治植物病原体表现出了极大的潜力。BOUACEM等[13]研究发现嗜热氢化嗜麦芽寡头菌株KB-DZ44中能产耐高温的甲壳素酶ChiA-Hh59，纯化后的甲壳素酶在60 ℃温育36 h后其最大酶活为3 000 U/mL。

2 甲壳素酶的分类

甲壳素酶有多种分类方法，可根据其分泌性、切口位置、等电点以及氨基酸序列的不同来分类。

2.1 分泌性

根据甲壳素酶的分泌性可分为胞内甲壳素酶和胞外甲壳素酶，绝大多数的微生物所产的甲壳素酶都为胞外酶[14]。因此在做甲壳素酶菌株筛选时，大多采用比较水解圈大小来选择目标菌株。这种甲壳素酶都是属于诱导型的，即在底物甲壳素的诱导下向胞外分泌酶来降解底物生成壳寡糖或单糖再进行利用[2，15]。

2.2 切口位置

根据甲壳素酶的切口位置以及初级产物不同，可以分为甲壳素内切酶和甲壳素外切酶。甲壳素内切酶从甲壳素糖链内部随机切断，水解产物为二糖或寡糖等[16]。而甲壳素外切酶是从甲壳素的非还原端依次切断得到单糖[17]。

2.3 等电点

按照酶等电点的不同，可以将甲壳素酶划分为酸性、中性和碱性甲壳素酶。微生物产的甲壳素酶多为酸性酶，而植物产的甲壳素酶多为碱性酶，也有少部分产酸性酶，且二者有可能出现在同一植株中[18]。

2.4 氨基酸序列同源性

根据氨基酸序列的同源性，甲壳素酶被分为18和19两个家族。18家族的甲壳素酶广泛存在于动物、植物和微生物中，而19家族的甲壳素酶主要存在植物内，在少部分放线菌中也有存在。18家族的甲壳素酶的催化区域都包括2个Asp和1个Glu，其应该为18家族甲壳素酶的关键活性氨基酸[19-20]。18家族甲壳素酶的水解产物与19家族甲壳素酶的水解产物完全不同，18家族的甲壳素酶的水解产物都是β异构体，而19家族的甲壳素酶的水解产物均为α异构体[18]。18、19家族的甲壳素酶的催化机制差别也很大，且完整的催化机制有待进一步研究[20-21]。

3 甲壳素酶的分子生物学研究

在甲壳素酶的分子生物学研究中，研究最多的为甲壳素酶基因的克隆表达，通常将细菌甲壳素酶基因在大肠杆菌系统中表达，将真菌甲壳素酶基因在酵母系统中表达。而常规来源的筛选方法并不能快速地筛选到高效产酶基因。因此有部分研究者采用随机突变的方法进行高通量筛选或对基因定点突变，从而筛选到优良性状的产酶基因。为了研究甲壳素酶的功能和性质，部分研究者通过构建基因缺失突变体来进行研究。

3.1 随机突变

CHEN等[22]为了提高来自秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的甲壳素酶的降解能力和杀死线虫的活性，通过易错PCR技术构建了一个随机突变体文库进行高通量筛选。突变型甲壳素酶的半数致死浓度与野生型相比降低20%，杀死线虫的活性大大提升。研究还发现，突变型甲壳素酶减少了底物与底物结合位点Asp141之间的距离，最终导致底物亲和力，催化效率和比活性的增加。

3.2 定点突变

定点突变是一种高效快速改变目的基因表达蛋白的产量和性状的方法，通常采用PCR的方法向目的基因中引入所需的变化，通常为碱基的替换、增减等。FAN等[23]研究发现Lymantriadispar几丁质酶中的2个天冬氨酸残基(D143，D145)和1个色氨酸(W146)是在家族18几丁质酶催化区的第2个保守基序内观察到的高度保守的残基，其从L.dispar克隆了几丁质酶cDNA LdCht5，并且使用定点突变的方法用其他3种氨基酸分别、组合、全部取代3种残基制备7种突变型甲壳素酶，研究发现突变酶酶活稳定的pH范围变广，在特定pH值下，突变型甲壳素酶的稳定性优于野生型。

3.3 基因缺失突变体

反向遗传学经常通过制备目的基因功能缺失突变体来研究该基因的功能，CRISPR/Cas9工具基因编辑工具以及RNA干扰技术是目前常用的制备方法[24]。SUN等[25]利用CRISPR/Cas9工具敲除脊尾白虾的几丁质酶基因(EcChi4)来制备EcChi4基因的功能缺失体从而研究EcChi4基因的免疫防御功能。研究发现，在受到副溶血性弧菌或嗜水气单胞菌攻击时，EcChi4缺失组的虾的死亡率显著高于野生型组，由此证明EcChi4基因具有免疫防御功能。RNAi(RNA干扰)是通过序列特异性方式沉默靶基因的技术。GANBAATAR等[26]选择几丁质酶基因作为靶基因，将靶基因的干扰序列克隆到L4440载体中以产生序列特异性dsRNA(双链 RNA)，将重组L4440载体转化入大肠杆菌菌株 HT115(DE3)中，将基因工程菌直接喂养给受体昆虫Mythimnaseparata。研究发现口服大肠杆菌表达的dsRNA的受体昆虫也会发生RNAi效应，M.separata内源性基因表达被沉默，M.separata的甲壳素酶基因缺失突变体的死亡率增加和幼体体重下降。上述研究结果表明甲壳素酶具有抑菌活力，提高免疫防御以及促进昆虫发育等功能。

4 固定化甲壳素酶

为了使甲壳素酶广泛应用于工业化，其固定化研究也越来越受人们关注。MOHAMMADZADEH等[27]将纯化的Chit36酶固定在Ca2+交联的海藻酸盐/海泡石(AlgSep)纳米复合物珠粒中，以改善生物催化过程期间Chit36酶的催化活性和稳定性，研究发现藻酸盐纳米复合物珠中的Chit36的催化活性比不含海泡石的藻酸盐珠粒中的固定化Chit36高，该项研究在制药等工业上具有广泛的应用前景。

5 甲壳素酶的应用

5.1 农业

甲壳素酶具有抗虫和抗真菌作用，由于真菌细胞壁和昆虫骨骼中都含有大量的甲壳素，在甲壳素酶的作用下水解甲壳素造成真菌和害虫的死亡[28-30]。甲壳素酶可以用来解决由害虫和真菌作用导致的农作物减产问题，同时不会对环境造成污染和损害。用几丁质酶分解植物病原体进行的生物防治在农业中的应用越来越受到重视。GURAV等[31]从贝类加工工业土壤中分离出2种不同的菌株RST25和SUK25可以分解甲壳素，RST25酶活较高并被鉴定为短小芽孢杆菌，在体外测定中，短小芽孢杆菌RST25能显著抑制植物病原菌Fusariumsolani和Aspergillusniger，短小芽孢杆菌RST25及其产生的几丁质酶可以作为抗真菌植物病原体的生物防治剂。除此以外，将甲壳素酶基因转化到农作物中构建转基因食品的研究越来越受到人们的关注。KHAN等[32]通过农杆菌介导的转化方法将甲壳素酶基因重组到马铃薯内开发了过表达内切几丁质酶基因的转基因马铃薯(品种Desiree)，研究表明转基因马铃薯能显著抑制植物病原真菌包括链格孢菌(Alternariasolani)的生长。KHAN等[33]将甲壳素酶基因(NiC)转化到甘蓝型油菜中，发现转基因甘蓝型油菜能抑制常见真菌病原体交链孢菌(Alternariabrassicicola)的活性。抗真菌转基因食品对环境的影响广受关注。KHAN等[33]研究发现转基因甘蓝型油菜与非转基因甘蓝型油菜之间的土壤酶活性没有明显差别，对根际土壤进行微生物多样性分析发现NiC甘蓝型油菜品系可能不会影响根际土壤的微生物活性和群落结构。品种之间根际土壤进行微生物多样性的差异可能是测试参数的微小变化导致。甲壳素酶转基因农作物能有效抵抗植物病原体的侵害，大大提高产量，同时并未对环境造成影响，具有很广阔的农业应用前景。

5.2 畜牧业

自然界中甲壳素含量很高，但目前对甲壳素利用度很低。含有甲壳素的生物体被认为是新型动物饲料资源，但动物无法消化甲壳素，这就极大地限制了甲壳素在畜牧业上的应用。TABATA等[34-35]研究发现酸性甲壳素酶(Chia)可以在小鼠，鸡和猪胃组织中高度表达，并且它可以在动物的胃肠道(GIT)中消化甲壳素，且酸性甲壳素酶(Chia)可以对胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白水解活性产生抗性，这意味着在动物胃中成功表达的甲壳素酶并不会轻易被蛋白酶水解。酸性甲壳素酶可以作为动物饲料添加剂，可以将甲壳素制成动物可食用饲料，提高甲壳素利用率。

5.3 工业

甲壳素酶的工业化生产一直是人们的研究重点。KIDIBULE等[36]将来自Trichodermaharzianum的甲壳素酶Chit42基因在巴斯德毕赤酵母中表达，采用分批补料的发酵方法，甲壳素酶的产量可以达到约3 g/L。KIM等[37]在从韩国本土小牛粪便中分离出几丁质酶Escherichiafergusonii菌株，在pH值为7.0和30 ℃的最适条件下，深层发酵几丁质酶活达到最大，为7.24±0.07 U/mL。在这项研究中，发现蔗糖，酵母提取物，(NH4)2SO4和NaCl可能会提高外切几丁质酶的活性。AOUNALLAH等[38]运用响应面法优化地衣芽孢杆菌AT6菌株(BacilluslicheniformisAT6 Strain)的发酵培养基，将初始甲壳素酶的酶活提高近10倍达到505.26±22.22 mU/mL。目前对甲壳素酶的工业化研究都集中在提高甲壳素酶的酶活上，对利用甲壳素酶生产壳寡糖的研究较少。

6 展望

甲壳素酶具有良好的抗菌抗虫特性，在生物防治上具有广阔的应用前景。甲壳素酶还能快速降解甲壳素帮助生物体消化利用甲壳素，提高自然界中甲壳素的利用率。而工业化生产稳定性好、酶活高的甲壳素酶是一直困扰人们的难题。因此，人们从工业发酵条件、固定化方法、异源表达高产酶基因等方面进行研究，以促进发展甲壳素酶工业化步伐[39-40]。

目前，虽然甲壳素酶已经商业化，但其发酵水平较低，发酵成本较高，这将限制甲壳素酶的广泛应用。一方面，要寻找甲壳素酶新的来源和低价培养基，在提高甲壳素酶发酵水平的同时降低发酵成本；另一方面，要深入研究利用甲壳素酶发酵生产壳寡糖的技术，提高酶法产壳寡糖的产量和纯度。