脓毒症患者CD4+CD25+调节性T细胞检测的临床意义

邵 敏，刘 宝，王锦权，陶晓根，周树生，金 魁，张翠萍

（1.安徽省立医院 ICU，安徽 合肥 230001；2.安徽省立医院中心实验室，安徽 合肥 230001）

脓毒症患者CD4+CD25+调节性T细胞检测的临床意义

邵 敏1，刘 宝1，王锦权1，陶晓根1，周树生1，金 魁1，张翠萍2

（1.安徽省立医院 ICU，安徽 合肥 230001；2.安徽省立医院中心实验室，安徽 合肥 230001）

目的 探讨脓毒症患者CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）的水平与机体细胞免疫状态的关系及其检测的临床意义。方法将脓毒症患者40例按照疾病严重程度分为3组：脓毒症组14例，严重脓毒症组15例，脓毒症休克组11例。所有入选的40例脓毒症患者在入选当天行流式细胞术检测血中CD4+CD25+调节性T细胞的比例和CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平。比较脓毒症组、严重脓毒症组和脓毒症休克组血中CD4+CD25+调节性T细胞比例变化和CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平变化。同时选取20例健康人为对照组。结果 健康对照组CD4+CD25+调节性T细胞表达率脓毒症休克组最高，严重脓毒症组次之，脓毒症组最低，三组间两两比较差异有统计学意义（P＜0.05）。脓毒症组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+较正常对照组明显升高（P＜0.05）， CD8+较正常对照组差异不明显（P＞0.05）。严重脓毒症组和脓毒症休克患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较正常对照组明显降低（P＜0.05），CD8+较正常对照组改变不明显（P＞0.05）。结论 脓毒症患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞表达增加，可能导致CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平降低，免疫抑制加强。提示CD4+CD25+调节性T细胞在脓毒症的免疫发病机制中可能起着重要作用，对评估患者预后有临床价值。

脓毒症；细胞免疫；CD4+CD25+调节性T细胞

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征（systemicinf lammatoryresponsesyndrome，SIRS）。脓毒症发病机制中，除病原微生物及其毒素直接损害组织细胞外，免疫功能紊乱对其发生发展起重要作用。

CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）是近年来新发现的一种负向免疫调节细胞，它可以通过许多途径影响机体的免疫状态[1]，抑制炎症反应。人CD4+CD25+调节性T细胞根据CD25表达数量或荧光强度分为弱、中、强3个等级，目前认为CD25强阳性的CD4+T细胞（CD4+CD25high）能特异性代表人CD4+CD25+T细胞[2]。但目前有关脓毒症患者CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）与CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+等细胞免疫指标变化关系的临床报道较少[3]。本文就这方面的问题进行了探讨。现将试验结果分析如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年1月至2010年11月入住安徽省立医院ICU的脓毒症患者40例，疾病构成包括：消化道穿孔破裂术后16例，胆囊坏死及重症胆管炎9例，肠梗阻术后6例，重症肺部感染9例。入选患者均符合2001年12月在美国华盛顿召开的国际脓毒症定义会议所制定的脓毒症诊断标准[4]，并根据其中的分级标准将患者分为3组：脓毒症14例，男8例，女6例，年龄（57.1±14.2）岁；严重脓毒症15例，男9例，女6例，年龄（58.1±15.9）岁；脓毒性休克11例，男7例，女4例，年龄（59.4±11.7）岁。排除以下患者：患有自身免疫系统疾病、急性脑卒中、心肌梗塞、病毒性肝炎、HIV感染，入院前3月内使用过激素或免疫抑制剂。选取20例正常人作为健康对照组。

1.2 监测指标

1.2.1 一般监测指标在连续性治疗期间监测记录生命体征、动脉血气和血乳酸水平变化，评估急性生理和慢性健康评分系统评分（APACHEII评分）[5]。1.2.2 试验指标

1.2.2.1 试剂和仪器异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD25单抗，藻红蛋白（PE）标记的CD4单抗和CD25同型阴性对照试剂以及CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS试剂（均购自美国Beckman-Coulter公司）。固定和改变细胞膜渗透性试剂盒（FIX&PERMCellPermeabilizationKit均购自美国eBioscience公司）。流式细胞仪型号为美国Beckman-Coulter公司临床应用型（EPICS-XLIIMCL），荧光激发光波长为488 nm，分析系统软件为SystemⅡ系统。

1.2.2.2 标本收集 符合脓毒症诊断标准的患者于入选当天采肘静脉血10 mL，4 h内对标本进行处理与检测。另20例健康者作为对照组同期进行试验。

1.2.2.3 流式细胞仪检测CD4+CD25+调节性T细胞和CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+

CD4+CD25+Treg细胞的标记和分析方法参照文献[6]：首先在试管中加抗凝全血25μL，后分别加入CD25-FITC、CD4-PE单抗各5μL，充分混匀后室温避光反应15 min，加入500 uL溶血剂，37℃水浴箱放置10 min左右，待完全溶血时立刻上流式细胞仪检测CD25强阳性的CD4+T细胞（CD4+CD25high）特异性代表人CD4+CD25+T细胞。

T淋巴细胞亚群测定：使用（直接免疫荧光标记法）全血流式细胞仪三色标记法，取100μL全血，肝素抗凝加入20μL荧光标记的CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体，避光反应30 min后，加入0.83%氯化胺（NH4CL）溶血后上机检测，分析至少5 000个单个核细胞群，确定CD3+、CD4+、CD8+的百分比，计算CD4+/CD8+。

1.3 统计学分析

所有数据用SPSS 13.0统计软件包进行分析。计量资料用“”表示，作成组t检验和单因素方差分析。计数资料作χ2检验。在P=0.05的水平上做主要效应的显著性检验。

2 结果

2.1 脓毒症患者各亚组临床资料比较

脓毒症患者三个亚组年龄，性别构成比等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。血乳酸水平、APACHEⅡ评分、氧合指数3组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05），（表1）。

2.2 脓毒症亚组与健康对照组间外周血CD4+CD25high表达和CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的

表1 3组病人临床资料的比较（）

表1 3组病人临床资料的比较（）

注：aP ＜0.05，vs 脓毒症组；bP＜0.05，vs 严重脓毒症组；cP ＜0.05，vs脓毒症组。

组别 n 男/女 年龄（岁） 氧合指数（kPa） APACHE II 血乳酸水平（mmol/L）脓毒症组 14 8/6 57.1±14.2 36.2±8.0 9.4±2.7 1.6±0.9严重脓毒症组 15 9/6 58.1±15.9 26.5±9.1a 16.6±4.1a 2.6±0.8a脓毒症休克组 11 7/4 59.4±11.7 14.9±4.7bc 27.1±3.5bc 4.6±0.9bc F（或χ2） 0.108 0.075 23.4 79.5 35.3 P 0.947 0.928 0.00 0.00 0.00

脓毒症患者CD4+CD25high表达较正常人明显升高（P＜0.05），脓毒症休克组CD4+CD25highTreg表达最高（P＜0.05），严重脓毒症组较脓毒症组升高（P＜0.05）。脓毒症组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+较正常对照组明显升高（P＜0.05），CD8+较正常对照组差异不明显（P＞0.05）。严重脓毒症组和脓毒症休克患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较正常对照组明显降低（P＜0.05），CD8+较正常对照组改变不明显（P＞0.05）（表2）。

2.3 脓毒症患者CD4+CD25high与APACHEII评分、血乳酸水平和CD4+/CD8+的相关性分析

脓毒症患者血乳酸水平与APACHEII评分成正相关（r=0.640，P=0.01水平）CD4+CD25high与APACHEII评分成正相关（r=0.829，P=0.01水平）和乳酸水平成正相关（r=0.627，P=0.01）。CD4+CD25high与CD4+/CD8+呈负相关（r=-0.584，P=0.01）。

3 讨论

脓毒症免疫发病机制极其复杂，目前认为促炎反应／抗炎反应动态失衡是脓毒症进展为严重脓毒症、脓毒性休克和多器官功能不全的（MODS）的原因之一[7]。

T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+均是T细胞重要的表面抗原标志（属T细胞辅助受体），它们作为免疫效应细胞在直接杀伤靶细胞进行免疫调节等方面发挥着重要的功能。CD3+淋巴细胞为全血T淋巴细胞；CD4+细胞为辅助/诱导T淋巴细胞（Th/Ti），在细胞免疫的效应阶段和变态反应中能产生多种淋巴因子，导致炎症反应，从而加速消除抗原物质；CD8+细胞可对靶细胞产生细胞介导的细胞毒作用，即直接杀伤带有特异性抗原的细胞或相应的靶细胞，对CD4+细胞具有调节性抑制作用，CD4+/CD8+比值可反映机体的免疫功能状态[8]，CD4+/CD8+比值降低反映细胞免疫功能的抑制。

表2 脓毒症亚组与健康对照组间外周血CD4+CD25high和T细胞亚群表达的比较（）

表2 脓毒症亚组与健康对照组间外周血CD4+CD25high和T细胞亚群表达的比较（）

注：*P＜0.05，vs 正常对照组；# P＜0.05，vs 脓毒症组；## P＜0.05，vs 严重脓毒症组。

组别 n 年龄（岁） CD4+CD25high（%） CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+ / CD8+正常对照组 20 50.6±10.7 0.39±0.23 65.2±16.7 43.1±9.4 17.5±6.0 2.83±1.28脓毒症组 14 57.1±14.2 1.72±0.59* 70.3±18.9* 49.4±14.8* 17.2±7.5 3.47±2.06*严重脓毒症组 15 58.1±15.9 2.72±0.22# 45.9±9.6# 26.3±9.4# 17.1±7.5 1.91±1.01#脓毒症休克组 11 59.4±11.7 3.55±0.51## 36.5±10.1## 20.3±7.0## 16.6±6.7 1.70±0.89##F 1.522 28.58 22.935 22.804 0.939 4.736 P 0.219 0.00 0.00 0.00 0.428 0.005

CD4+CD25+调节性T细胞（Treg细胞）是1995年Sakaguchi等在小鼠体内发现的，在脓毒症复杂的免疫调节网络中主要发挥着对细胞免疫的抑制作用。脓毒症时机体表现为CD4+CD25+调节性T细胞水平持续增高，从而加剧免疫无反应状态。研究表明脓毒症患者体内存在过多的Treg细胞，可以通过细胞接触机制和释放IL-10、TGF-β等细胞因子诱导淋巴细胞凋亡，下调树突状细胞（DC）表面分子CD80／CD86表达，抑制CD4+、CD8+T细胞功能及影响Thl／Th2极化，决定着炎症反应的不同结局[9]。

本研究通过对脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克患者细胞免疫的监测，观察到脓毒症患者表现为CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较正常对照组明显升高，CD8+差异不明显。严重脓毒症组和脓毒症休克患者表现为：CD3+、CD4+、CD4+/CD8+较正常对照组明显降低。CD8+较正常对照组改变不明显。另外，本研究中脓毒症休克病人CD4+CD25+调节性T细胞较脓毒症组和严重脓毒症组明显升高，严重脓毒症组与脓毒症组比较是升高的。并且相关性分析表明：CD4+CD25+调节性T细胞与APACHII评分和血乳酸水平成正相关（r=0.829，r=0.627，P=0.01）。与CD4+/CD8+成负相关（r=-0.584，P=0.01）。说明随病情加重，脓毒症患者发生细胞免疫低下可能与CD4+CD25+Treg的升高有因果关系，其机制可能是：CD4+CD25+Treg可以通过导致抗炎细胞因子：转化生长因子β（TGF-β）和IL-10的升高，抑制淋巴细胞的增殖，并诱导高表达FAS和FASL的活化，T淋巴细胞发生FAS-FASL结合，通过Caspase级联反应，导致T淋巴细胞彼此杀伤或直接“自杀”[10]，使T细胞总数和活化的T细胞数量下降。此外，CD4+CD25+Treg经TCR介导的信号刺激活化后，能抑制CD4+和CD8+T细胞活化和增殖,使Th1向Th2漂移[11]，使免疫亢进转向免疫抑制。本研究提示随病情严重程度增加，CD4+CD25+调节性T细胞数量增加，导致CD4+、CD4+/CD8+下降，对脓毒症患者的免疫功能抑制加强，最后导致病人免疫麻痹。在感染和持续升高的前炎症因子（TNF-α、IL-1β等）等损害下导致病人的高死亡率的发生。

综上所述，本文详述了脓毒症患者CD4+CD25+Treg与T细胞亚群：CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的关系，揭示了CD4+CD25+Treg细胞在脓毒症患者细胞免疫抑制状态中的作用。提示临床检测脓毒症患者CD4+CD25+Treg细胞水平可以预测患者的预后。但目前关于CD4+CD25+Treg在脓毒症中的研究尤其是临床观察还很有限，许多确切的调控机制等诸多问题都有待于更深入的探讨。随着CD4+CD25+Treg对机体免疫状态及调节机制认识的日益深化，许多作用环节都可能成为临床干预的切入点，从而为防治脓毒症及其他感染性疾病提供新策略。

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Clinic significance of Testing CD4+CD25+Treg cells in patients with sepsis

SHAO Min, LIU Bao, WANG Jin-quan, TAO Xiao-gen,ZHOU Shu-sheng,JIN Kui,ZHANG Cui-ping
(An Hui Provincial Hospital,He Fei,Anhui 230001,China)

Objective To study the level and significance of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells in peripheral blood of patients with sepsis.Methods 40 patients with sepsis Patients were divided into three groups: sepsis group(n=14), severe sepsis group(n=15), and septic shock group (n=11).The expression of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells of 40 patients on the day 1 was detected by flow cytometry. The comparision in the expression of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells within groups was made. Twenty healthy individuals served as controls.Results The expression rate.The expression of CD4+CD25+Treg cells was the highest in septic shock group(P＜0.05) followed by the severe sepsis group (P＜0.05) and the sepsis group the lowest(P＜0.05).The level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+in sepsis group was higher than control group and the level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+in severe sepsis and sepsis shock was lower than control group.Conclusion The expression of CD4+CD25+Treg cells was increased in sepsis patients and the level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+was low in severe sepsis and sepsis shock patients,suggesting that they may play an important role in pathogenesis of sepsis.Blood Treg% level can reflect the cell immune state of patients with sepsis and is of clinical value to assess the prognosis.

Sepsis;Cell immunity;CD4+CD25+Treg cells

R631

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.003.008.03

2011－01－20

邵 敏（1976－），男，安徽合肥人，在读博士，主治医师，主要从事危重症急救工作。

马宏宇）