米托蒽醌联合顺铂对脑胶质瘤U87细胞株的影响

周红建 王雄伟 刘朝奇 覃晓琳 孙俪 汪雷 王旭光

米托蒽醌联合顺铂对脑胶质瘤U87细胞株的影响

周红建*王雄伟*刘朝奇△覃晓琳△孙俪△汪雷*王旭光*

目的 体外观察米托蒽醌(mitoxantrone，NVT)联合顺铂(cisplatin，CDDP)对脑胶质瘤U87细胞株的增殖抑制作用及可能的协同机制。方法 MTT法检测浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL NVT、CDDP以及两药物联合对U87细胞的增殖抑制作用。RT-PCR法检测CDDP、NVT及两药联合对U87细胞上Bcl-2和Bax基因表达的影响。结果 MTT法检测结果显示，NVT浓度为0.3125μg/mL联合相同浓度CDDP时，两药联合能明显增强其对U87细胞的增殖抑制作用(67.7% ±1.5%);RT-PCR法检测显示，CDDP组Bax基因的表达明显高于正常对照组，但对Bcl-2基因无此作用;低浓度的NVT和两药联合Bcl-2基因的表达明显低于正常对照组及顺铂组。结论 胶质瘤U87细胞在化疗药物NVT和CDDP两药物联合作用下可通过诱导Bcl-2/Bax基因表达量的改变，协同发挥其促凋亡作用，从而增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

脑胶质瘤 联合 Bcl-2/Bax 米托蒽醌 顺铂

胶质瘤约占颅内原发肿瘤的40%～50%［1］。在美国，2005年就有1.85万新增恶性原发性神经系统肿瘤患者［2］。目前对神经胶质瘤的化疗倾向于联合用药，根据细胞动力学和药物对细胞周期的特异性，用两种以上药物，甚至多种药物联合应用以提高疗效。目前有许多联合用药方案，如伊立替康和卡莫司汀联合、丙卡巴腆与长春新碱和洛莫司汀联合、埃罗替尼、吉非替尼和贝伐单抗联合伊立替康等治疗策略［3］已经在进行或完成了相关临床研究，并取得良好效果。本研究主要探讨米托蒽醌(mitoxantrone，NVT)联合顺铂(cisplatin，CDDP)是否可以增强对U87细胞的抑制作用，以期改善化疗药物对预防脑胶质瘤术后复发的效果。通过观察用药前后U87细胞上Bcl-2或Bax基因的变化，对其机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 研究对象 脑胶质瘤细胞株U87由同济医学院神经外科实验室惠赠。RPMI1640、胎牛血清购于美国Sigma公司产品。米托蒽醌购自山东罗欣药业股份有限公司，顺铂购自齐鲁制药有限公司，MTT细胞增殖分析试剂为Promega公司产品。PCR仪为美国Bio-Rad公司产品。全波长酶标仪为Thermo公司产品。

1.2 细胞培养与试剂配置 U87细胞用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，2～3 d更换1次培养液，待细胞融合达80%时即消化传代，取对数生长期细胞进行实验。CDDP和NVT均用PBS配制成1mg/mL的储存液，放置于－20℃冰箱保存，使用时稀释至相应终浓度。

1.3 MTT法检测细胞的增殖抑制率 取对数生长期细胞，以1.5×104个/mL的细胞密度接种于96孔板中，100μL/孔。按 Chou-Talalay 联合指数法［4］实验设计一般原则，分组如下:CDDP组分别按 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL共6个浓度梯度给药;NVT组分别按 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL 共 6个浓度梯度给药;联合用药组中CDDP、NVT浓度分别为 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μg/mL，按 2 药相同浓度间进行两两组合。每个浓度设3个复孔，共设置细胞对照组(不加药物)、CDDP组、NVT组和联合药物组。待药物作用48 h后终止培养。加入MTT溶液(5 mg/mL)100μL/孔，继续培养4 h后终止培养，去上清，加入 DMSO 100μL/孔，水平缓慢振荡 10～15 min使晶体充分溶解，用酶标仪在波长490 nm处读取各孔吸光度(OD)值。按以下公式计算各组细胞的增殖抑制率(inhibition rate，IR)。IR=(1－OD实验孔/OD对照孔)×100%。按金正均提出的概率和法计算Q值并判断2药的协同作用［5］。Q=E(A+B)/［EA+(1－EA)×EB］，其中E(A+B)为两药联合应用时的细胞增殖抑制率，EA和EB分别为两药单独应用时的细胞增殖抑制率。当Q为0.85～1.15时，表示两药作用相加;当Q＞1.15时，表示两药作用协同;当Q＜0.85时，表示两药相互拮抗。

1.4 RT-PCR法检测细胞上Bcl-2和Bax基因的表达 分别收集经药物处理48 h和未经药物处理的U87细胞株，总RNA提取和RT-PCR分别按相应试剂盒说明书进行。PCR引物 Bcl-2:上游 5'-TCGCCCTGTGGATGACTGAG-3'，下 游 5'-CAGAGTCTTCAGAGACAGCCAGGA-3'，产物 176 bp;Bax:上游 5'-CAGGATGCGTCCACCAAGAA-3'，下 游 5'-GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3'，产物 165 bp;β-actin 为内参照，上游引物为5'-TGGCACCCAGCACAATGAA－3'，下游引物为 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，产物 186 bp。用2%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶扫描仪下扫描结果并进行灰度分析。

1.5 统计学方法应用SPSS 13.0进行分析，以¯x±s表示。同一药物不同浓度组间采用单因素方差分析进行比较，多组间两两比较采用LSD-t检验进行分析，α=0.05。

2 结果

2.1 细胞的增殖抑制率 NVT单药各浓度间细胞的增殖抑制率差异有统计学意义(F=39.125，P＜0.01);CDDP组对U87细胞的增殖有明显的抑制作用，并且随着药物浓度的增加，其对U87细胞的增殖抑制作用逐渐增强(F=21.986，P＜0.01);联合用药组对U87细胞的增殖有也具有明显的抑制作用，随着药物浓度的增加，其对U87细胞的增殖抑制作用逐渐增强(F=39.286，P＜0.01);当NVT联合相应浓度CDDP时，联合用药组与相应浓度NVT、CDDP单药组比较，其细胞的增殖抑制率明显提高，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 联合用药协同作用判断结果 按上述计算Q值:当米托蒽醌浓度为0.625μg/mL、0.3125μg/mL，与相应浓度的顺铂联合应用时，其Q值分别为1.17和1.64，表示两药间联合具有协同作用(Q＞1.15);当米托蒽醌浓度为 1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10μg/mL，与相应浓度的顺铂联合应用时，则表示相加作用(Q值为0.85～1.15)。

2.3 细胞形态变化 顺铂浓度为0.3125μg/mL、米托蒽醌浓度为0.3125μg/mL及两药联合组处理后镜下细胞形态变化。见图1。

表1 NVT和CDDP作用48h时胶质瘤U87细胞的增殖抑制率

图1 倒置相差显微镜下细胞形态(100×)。A:正常细胞组;B:顺铂组(0.3125μg/mL);C:米托蒽醌组(0.3125μg/mL);D:联合组:(0.3125 μg/mL)

2.4 RT-PCR法检测U87细胞上Bcl-2和Bax基因的表达 检测胶质瘤U87细胞经药物处理和未经药物处理48h后Bcl-2和Bax基因mRNA表达的变化，以β-actin为内参照，经过密度扫描和灰度分析发现:Bax基因未经化疗药物时，其在U87细胞表达不明显，而当CDDP处理后Bax的mRNA表达水平显著高于正常对照组。Bcl-2基因在未经药物处理和经顺铂处理后均呈高表达，当NVT或两药联合处理后可下调Bcl-2的mRNA表达。见图2。

图2 RT-PCR检测Bcl-2和Bax基因在U87细胞中的表达。PBS:正常对照组;CDDP:顺铂组(终浓度为0.3125μg/mL);NVT:米托蒽醌组(终浓度为0.3125μg/mL);C+N:顺铂联合米托蒽醌(终浓度为0.3125μg/mL)

3 讨论

胶质瘤具有侵袭性和易复发的特点，多为恶性［6］。化疗是预防恶性胶质瘤术后复发的关键。米托蒽醌是细胞周期非特异性广谱抗癌药，作用机制主要是抑制DNA合成，它可与碱基强有力地结合而嵌入DNA，引起DNA链间和链内交叉连结，导致单链与双链断裂;其次NVT对RNA聚合酶亦有抑制作用。NVT可杀灭任何细胞周期的肿瘤细胞，使增殖与非增殖细胞均受到抑制，但对S2期细胞最为敏感。顺铂是临床治疗各种恶性肿瘤常用的一线化疗药物，抗癌作用强，抗癌活性高，易与其他抗癌药配伍，且少有交叉耐药性，有利于临床的联合用药。然而，对于部分恶性胶质瘤患者，在单用CDDP或NVT化疗后，疗效不甚满意，且仍具有较高的复发风险。因此，寻找能够增强CDDP对胶质瘤细胞杀伤作用的方法，对预防术后复发和改善患者生存具有积极的意义。

细胞凋亡是生物体发育过程中普遍存在的，是一个由基因决定的细胞主动的有序的死亡方式［7］。Bcl-2是抑制凋亡基因，位于18q21上，约230 kb，含有3个外显子和2个启动子，其编码产物位于线粒体内膜上，主要存在于造血细胞、神经元的线粒体膜、细胞核膜和内质网中。Bax为重要的促细胞凋亡基因之一，与Bcl-2有21%的同源性，有对抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，Bcl-2＞Bax，细胞趋于存活;Bax＞Bcl-2，细胞趋于凋亡［8］。多数学者认为，恶性胶质瘤术后肿瘤复发的主要原因之一是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药，但是目前关胶质瘤细胞对化疗药物的耐药机制仍不明确。有关肿瘤细胞耐药的众多研究认为，Bcl-2基因的表达可引起胶质瘤细胞对化疗药物治疗不敏感［9］。此外，王天路等［10］研究发现:下调Bcl-2基因表达可有效抑制神经胶质瘤细胞生长，降低细胞增殖和侵袭能力。

本研究发现，单用米托蒽醌或顺铂对胶质瘤U87细胞株的生长抑制及诱导凋亡作用显著，当米托蒽醌与顺铂联合应用时，能明显增强对U87细胞的增殖抑制作用，特别是在低浓度(≤0.625μg/mL)米托蒽醌时，这种协同作用更为明显。通过检测U87细胞用药后Bcl-2或Bax基因表达量的改变，米托蒽醌和联合药物组则可能通过下调Bcl-2基因的表达，从而使Bax＞Bcl-2，减弱其抑制细胞凋亡作用，增强化疗药物抗肿瘤活性的作用;顺铂可上调Bax基因的表达，从而使Bax＞Bcl-2，发挥其促进细胞的凋亡，从而增强化疗药物的抗肿瘤作用。当然，这仅仅是对米托蒽醌、顺铂作用机制初步的探讨，今后还需开展进一步的实验，诸如检测与靶DNA结合能力的改变以及众靶基因及相关蛋白表达水平的变化等。

综上所述，在体外环境下米托蒽醌联合顺铂能增强对脑胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用。当CDDP、NVT药物相应浓度分别≤0.625μg/mL联合用药时，两药存在明显的协同抑制作用(Q值＞1.15)。这不仅可以减少化疗药物的应用剂量，而且在一定程度上减轻了化疗药物对周围正常脑细胞的杀伤作用。化疗药物对胶质瘤细胞敏感性的高低，对胶质瘤患者临床个体化化疗效果有预见价值，可以帮助临床医生选择有效的化疗药物，设计合理有效的治疗方案，避免无效药物所致的不良反应，提高治疗效果。

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Effect of the combination of nitoxantrone and cisplatin on glioma cell line U87.

ZHOU Hongjian，WANGXiongwei，LIU Chaoqi，QIN Xiaolin，SUN Li，WANG Lei，WANG Xuguang.First Clinical Medical College＆Three Gorges University，Yichang Central People's Hospital;Institute of Molecular Biology，Three Gorges University，Yichang 443002.China.Tel:0717－6483495.

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of the combination ofmitoxantrone(NVT)and cisplatin(CDDP)on the proliferation of U87 glioma cells in vitro.M ethods Different concentrations of NVT(0.31，0.63，1.25，2.5，5 or 10)with or without same concentrations of CDDP were administered to U87 cell cultures and MTT assay was used to detect the proliferation of U87 cell proliferation.RT-PCR was used to detect Bcl-2 and Bax gene expression.Results MTT assay showed that NVT at concentration 0.3125μg/mLwith the same concentration of CDDP could significantly inhibit the proliferation of U87 cells(67.7±1.5).Bax but not Bcl-2 gene expression was significantly higher in CDDP group than in normal control group while Bcl-2 gene expression was significantly lower in both NVT low concentration and the combination groups compared with either control or CDDP alone groups.Conclusions U87 glioma cells in the NVT and CDDP chemotherapy combined effect of two drugs can induce the Bcl-2/Bax gene expression changes，collaborative play its role in inducing apoptosis，thereby enhancing tumor cell sensitivity to chemotherapeutic drugs.

Glioma Combination Bcl-2/Bax gene Mitoxantrone Cisplatin

R651

A

* 三峡大学第一临床医学院 宜昌市中心人民医院(宜昌443002)

E-mail:Wangxiongwei11@yahoo.com.cn)

△三峡大学分子生物所

2010－11－01)

(责任编辑:甘章平)

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