PI3K、AKT和m TOR在侵袭性垂体腺瘤中的表达

贺学农 霍钢唐茂源 冯清林

PI3K、AKT和m TOR在侵袭性垂体腺瘤中的表达

贺学农*霍钢△唐茂源△冯清林△

目的 研究磷酯酰肌醇－3－激酶(phosphatid－ylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又称AKT)和哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin，mTOR)在侵袭性垂体腺瘤中的表达，探讨其与垂体腺瘤侵袭性的关系。方法 61例垂体腺瘤分为侵袭性和非侵袭性两组，采用免疫组织化学技术检测PI3K、AKT及mTOR的蛋白表达，应用RT－PCR检测PI3K、AKT及mTOR的mRNA表达水平，分析比较两组肿瘤之间PI3K、AKT及mTOR的表达差异性。结果 在所检测的肿瘤组织标本中，有31例为侵袭性垂体腺瘤，另外30例为非侵袭性垂体腺瘤，免疫组化结果显示侵袭性垂体腺瘤PI3K、AKT、mTOR阳性表达率(61.29%、74.19%、54.84%)高于非侵袭垂体腺瘤(33.33%、43.33%、26.27%，P＜0.05)。PCR检测结果显示侵袭性垂体腺瘤组中PI3K、AKT、mTOR的相对表达量分别为(0.707±0.599、0.843±0.094、0.753±0.071)高于非侵袭性垂体腺瘤组(0.591±0.803、0.718±0.044、0.656±0.022，P＜0.05)。结论 PI3K、AKT及 mTOR 在垂体腺瘤的侵袭过程中可能发挥着促进其侵袭的作用。

垂体腺瘤 PI3K AKT mTOR 侵袭

侵袭性垂体腺瘤因其侵袭性强，手术难以完全切除，且术后复发率高等特点，成为临床上治愈垂体腺瘤的棘手问题之一。磷酯酰肌醇－3－激酶(phosphatid－ylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB，又称AKT)信号通路是与肿瘤细胞的生长、增殖、运动和侵袭密切相关。PI3K是一类特异的催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶。它可被多种生长因子激活，促进下游的信号分子活化，从而发挥生物学效应。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，它可以直接或间接活化其下游如哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin，mTOR)、p70S6K、Eif－4e 等多种分子蛋白。进而影响肿瘤细胞的各种生物学行为。mTOR是一种蛋白激酶，是AKT的下游分子。它通过调节4E－BPI和S6KI磷酸化而影响特定mRNA翻译的开始，从而进一步达到调控细胞生长和增殖。本研究致力于三者在侵袭性与非侵袭性垂体瘤中的表达。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究垂体瘤组织来源于重庆医科大学附属第一医院神经外科2009年3月至2009年12月期间所收治的61例垂体腺瘤患者。其中男24例，女37例，年龄(42.5±0.3)岁。侵袭性垂体腺瘤判断标准:①采用Wilson的Hardy分类法［1］将Ⅲ～Ⅳ级或C、D、E期的垂体肿瘤归为侵袭性垂体腺瘤;② 术前经影像学检查，CT及MRI可见海绵窦、鞍旁及下丘脑等邻近结构的破坏;③术中所取鞍底骨质或邻近硬脑膜经病理学证实有肿瘤细胞侵犯;④术中可见鞍底骨质及硬脑膜受侵袭破坏，肿瘤突入蝶窦腔或侵入鞍旁的血管神经。符合其中之一者即可确定为侵袭性垂体腺瘤。本研究中，31例为侵袭性垂体腺瘤，30例为非侵袭性垂体腺瘤，均由病理学报告确诊。手术时取所需组织用生理盐水洗净积血，一部分置入4%多聚甲醛溶液内固定，另一部分新鲜肿瘤组织，放入经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理过的冻存管中，置入液氮备用。实验所用Trizol试剂、RT－PCR试剂盒(TKKALA公司)，完成RT－PCR所需其他试剂均由重庆医科大学眼科实验室提供。PI3K、AKT和mTOR的单克隆抗体均购自美国Bioworld生物公司，兔抗羊IgG免疫二抗购自武汉博士德公司。SP试剂盒及DAB显色剂购自北京中山金桥生物技术有限公司，其他试剂由重庆医科大学组胚教研室提供。

1.2 免疫组织化学检测(SP法) 组织标本经石蜡包埋作5μm连续切片，1张作HE染色用于重新确认病理结果。免疫组化按试剂盒操作说明进行，阴性对照选择PBS代替一抗。阳性结果判断标准:PI3K以细胞质呈清晰黄色或棕黄色为强阳性，AKT以细胞质呈黄色或棕黄色为强阳性，mTOR以细胞质呈清晰黄色或棕黄色为强阳性。在高倍(×400)视野下计算200个肿瘤细胞(共计5个视野，取其平均值)，计算免疫反应阳性的细胞百分比。根据半定量免疫组织化学PI3K、AKT和mTOR反应阳性细胞显色强度及范围进行评价:①阴性(－):无阳性细胞染色。②弱阳性(+):阳性细胞小于50%或显色浅。③强阳性(++)阳性细胞大于50%或显色深。见图1。

1.3 逆转录－聚合酶链反应(RT－PCR)分析 参照Trizol试剂盒说明书提取肿瘤组织的总RNA，置于－80℃保存。提取的RNA含量可通过752型紫外分光光度计测定260 nm吸收值确定，按每OD260相当于40μg RNA计算RNA的产率，OD260在1.8～2.0视为抽提的RNA纯度很高。本实验采用两步法进行RT－PCR，首先用RT试剂盒(TKKALA公司)将提取出来的RNA逆转录成cDNA(具体方法按照说明书进行)，逆转录扩增条件:37℃ 15min，85℃ 5 s。然后将cDNA产物进行PCR扩增，PCR扩增条件:94℃预变性5 min;30循环:94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min;72℃延伸10 min。制备1.5%琼脂糖凝胶(含0.2 goodview)，分别取5μL PCR产物进行电泳，紫外灯下拍照，采用图像分析软件Quantity One比较电泳条带相对光密度值，从而获得PI3K、AKT及mTOR的相对表达量。引物序列:PI3K sense 5’TACACTGTCCTGTGCTGGCTAC 3’，antisense5’GCTTCTTCTTCACTCTTCCCTA 3’，长度 408 bp;AKT sense 5’GGAGCGGGAGGAGTGGACAA 3’，antisense 5’CGGGACAGGTGGAAGAACAGC 3’，长度 441 bp;mTOR sense 5’TGGCTTCTAAGTCTACCACGACAG 3’，antisense 5’GAGGTCCTTGACATTCCCTGATT 3’，长度，359 bp;β－action sense 5’TGACGTGGACATCCGCAAAG 3’，antisense 5’CTGGAAGGTGGACAGCGAGG－3’，长度 200 bp。

1.4 统计学分析数据用均数±标准差(¯x±s)表示，数据处理在SPSS 17.0上完成。统计方法中对蛋白阳性表达率的比较采用χ2检验，而对PCR结果的比较采用t检验。检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组化结果 在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中PI3K的阳性表达率分别为61.29%(19例)和33.33%(10例)，两组阳性表达率差异具有统计学意义(χ2=4.78，P＜0.05);AKT的阳性表达率分别为74.19%(23例)和43.33%(13例)，两组阳性表达率差异有统计学意义(χ2=6.01，P＜0.05)。mTOR的阳性表达率分别为54.84%(17例)和26.27%(8例)，两组阳性表达率差异亦有统计学意义 (χ2=4.80，P＜0.05)，见图1。

2.2 RT-PCR结果 侵袭性垂体腺瘤组PI3K、AKT和mTOR的mRNA相对表达量明显高于非侵袭性垂体腺瘤(其t值分别为 6.389，10.821，12.825;P＜0.05)。见图2－4，表1。

图1 A:侵袭性垂体腺瘤组织HE染色(×400);B:非侵袭性垂体腺瘤免疫组化阴性对照(－)(×400);C:侵袭性垂体腺瘤PI3K免疫组化表达阳性(++)(×400);D:非侵袭性垂体腺瘤PI3K免疫组化表达阳性(+)(×400);E:侵袭性垂体腺瘤AKT免疫组化表达阳性(++)(×400);F:非侵袭性垂体腺瘤AKT免疫组化表达阳性(+)(×400);G:侵袭性垂体腺瘤mTOR免疫组化表达阳性(++)(×400);H:非侵袭性垂体腺瘤mTOR免疫组化表达阳性(+)(×400)

图2 PI3K mRNA在垂体腺瘤中的表达1，2，3为侵袭性垂体腺瘤，4，5，6为非侵袭性垂体腺瘤，M为marker

图3 AKTmRNA在垂体腺瘤中的表达1，2，3为袭性垂体腺瘤，4，5，6为非侵袭性垂体腺瘤，M为Marker

图4 mTORmRNA在垂体腺瘤中的表达1，2，3为袭性垂体腺瘤，4，5，6为非侵袭性垂体腺瘤，M为Marker

表1 垂体腺瘤组织中PI3K、AKT和m TOR的mRNA的表达

3 讨论

肿瘤的发生、发展及预后是受多因素控制、多步骤调节的过程。许多学者在其他肿瘤(非垂体腺瘤)［1－2］的研究中均观察到PI3K/AKT/mTOR的高表达，说明这三个信号分子与肿瘤细胞的增殖与侵袭等生物学行为有着密不可分的关系。

在PI3K/AKT/mTOR这个信号串联的过程中，首先是PI3K被活化。PI3K是脂质酶家族的成员之一，普遍存在于细胞的胞质中，由一个催化亚基(p110)和调节亚基(p85)构成的异源二聚体。当PI3K被激活后，p110催化亚基可特异的磷酸化磷酸肌醇(PI)的肌糖环的D3位点，把底物Ptd Ins(4，5)P2(PIP2)转化为Ptd Ins(3，4，5)P3(PIP3)。PIP3作为第二信使激活下游的众多信号分子，由此导致信号的进一步传导，使PI3K信号传导通路在细胞的增殖、凋亡、迁移、膜泡转运和细胞的恶性转化等众多病理生理过程中起重要作用［3－4］。本研究结果证实，在侵袭性垂体腺瘤中PI3K的表达明显上调，可使第二信使PIP3明显增多，而PIP3可以激活更多的下游靶分子，特别是AKT，从而引起该信号通路的明显活化［5－6］。

AKT又称蛋白激酶B(PKB)，是PI3K的下游关键分子。AKT一般位于细胞的胞浆中。由480个氨基酸残基组成，包括氨基端的调节区、中间的激酶区和羧基端的尾部三部分，他们共同协调发挥AKT的生物学功能。在哺乳动物细胞中存在着三种Akt异构体(AKT l～3)，这三种由不同基因编码的蛋白拥有80%的序列一致性，并且功能大部分相同。PI3K/Akt激活可分三步:①活化的PI3K在膜上生成PIP3;②PIP3与Akt的PH结构域结合后引起Akt向细胞膜转位;③Akt继而被PI3K依赖激酶1(PI3K dependent kinase 1，PDK1)在催化区的苏氨酸308位点(Thr 308)磷酸化，同时被另一个未知的PI3K依赖激酶2(PDK2)在碳末端疏水区丝氨酸473位点(Ser 473)磷酸化，这两个位点同时磷酸化是Akt激活的必要条件。激活后的Akt蛋白再转位到胞浆中或胞核内，通过对一系列底物的磷酸化，激活或抑制其下游靶蛋白 Bad、caspase9、mTOR、核转录因子等多种生物活性分子［7－10］，进而调节细胞的增殖、分化、凋亡及侵袭。

雷帕霉素受体靶蛋白mTOR，其从酵母菌到哺乳动物保持着95%的同源性，是一个高度保守的蛋白。它由一个催化结构域、一个FKBP12－雷帕霉素结合域、一个自抑制结构域、一个HEAT域和一个FAT(FRAP.ATM－TRRAP)。mTOR受 pAKT的调控，是 AKT的下游靶蛋白。Akt通过磷酸化mTOR的Ser－448位点而激活mTOR。活化后的mTOR，可通过磷酸化或去磷酸化的形式调节 4E－BP1、S6K1 等分子的生物学行为［11－12］，从而调控细胞的mRNA的翻译过程。

侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤中肿瘤细胞的性质存在区别，因此某些促进肿瘤细胞侵袭生物活性分子的活化程度以及表达程度均存在明显差异。本研究结果显示，在侵袭性垂体腺瘤中PI3K、AKT、mTOR的 mRNA及蛋白表达水平均存在明显差异，侵袭组明显高于非侵袭组，因此，可推测侵袭性垂体腺瘤可能借由该信号通路的过表达从而发挥更强的侵袭能力。

此信号通路的激活，可能通过多种方式对肿瘤的发生、发展产生作用。它可通过磷酸化Bcl－2家族成员Bad基因，从而发挥Bcl－2家族的抗凋亡作用。另外它也可抑制caspase家族，阻滞凋亡产生。它还可以活化转录因子NF－kB，这个转录因子可以促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡。除了上述提到的几种方式，还可以通过其他的各种方式来促进细胞增殖、生长及抑制凋亡。PI3K/AKT/mTOR在其他常见肿瘤中的表达上调对多种生物活性因子的作用已得到证实［13－15］。

本课题小组的前期工作中已针对侵袭相关因子MMP、smac、caspase 等做了初步的研究［16－17］，本次研究对PI3K/AKT/mTOR在侵袭与非侵袭垂体腺瘤中的表达做了初步探索，为垂体腺瘤的相关研究提供了有用的科学资料。目前PI3K的特异性抑制LY294002已在肺癌、乳腺癌等的相关研究中证实其能有效的抑制PI3K的表达，那么如果将此特异性抑制剂用于垂体腺瘤的研究是否也能获得相同的效果呢?所以在以后的实验研究中，可在本研究的基础上将LY294002加入到后续实验中，对该信号通路进行特异性的抑制，然后可以进行再次的观察，明确在此信号通路被抑制后，垂体腺瘤的侵袭性是否能被减弱或者被抑制。

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The Role of PI3K、AKT and m TOR in invasive pituitary adenomas.

HE Xuenong，HUOGang，TANGMaoyuan，FENG Qinglin.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.Tel:023 －89011150.

ObjectiveTo study the role of PI3K，AKT，and mTOR in invasive pituitary adenomas and explore their relationship with the invasiveness of pituitary adenomas.Methodssixty－one cases of pituitary adenomaswere divided into two groups:invasive and non－invasive groups.The protein andmRNA expression levels of PI3K，AKT andmTOR were detected by using immunofluorescence analysis and reverse transcription polymerase chain reaction(RT－PCR).ResultsThere were 31 invasive pituitary adenomas and 30 non－invasive pituitary adenomas in all detected pituitary adenomas.PI3K，AKT and mTOR protein expression levels in invasive were higher in invasive(61.29%，74.19%and 54.84%)than in noninvasive pituitary adenomas(33.34%，43.33%and 26.27%，P＜0.05).The PCR result of PI3K、AKT、mTOR mRNA expression levelswere in invasive were higher in invasive(0.707±0.599，0.843±0.094 and 0.753±0.071)than in noninvasive pituitary adenomas(0.591±0.803，0.718±0.044 and 0.656±0.022，P＜0.05).ConclusionPI3K，AKT and mTORmay play an important role in the invasiveness of pituitary adenoma and thusmay be new targets for the treatment of invasive pituitary adenomas.

Pituitary adenoma PI3K AKT mTOR Invasion

R651

A

* 重庆市第二人民医院神经外科(重庆 400050)△重庆医科大学附属第一医院神经外科

E－mail:xiaomin198171@tom.com)

2010－12－20)

(责任编辑:甘章平)

·论 著·