重组人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的表达、纯化及免疫原性*

夏君慧， 翁益云， 李 佳， 张 旭

(温州医学院附属第一医院神经内科，浙江温州325000)

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)为少突胶质细胞膜结合糖蛋白，是中枢神经髓鞘的重要组成部分，研究显示抗MOG抗体在多发性硬化(multiple sclerosis，MS)的病理过程中起着非常重要的作用，由MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前国际上公认的MS动物模型［1］。目前国内所使用的MOG多为人工合成的MOG肽段。MOG细胞外Ig样结构域(extracellular immunoglobulin domain of MOG，MOGIgd)含有多个抗原表位，具有很强的免疫原性［2－5］，此研究旨在将编码 MOG1－100(包括 MOGIgd)的基因克隆到硫氧还蛋白(thioredoxin，TrxA)融合表达载体pET32a(+)中，在BL21(DE3)trxB－宿主菌中得到目的蛋白表达，并探讨表达产物MOGIgd－TrxA融合蛋白能否作为免疫原诱导EAE动物。

材料和方法

1 材料

1.1 菌种和质粒 大肠杆菌DH5α华山医院神经病研究所樊永峰博士惠赠;表达载体pET32a(+)(Novagen产品)由复旦大学医学院分子生物室孙兴会博士惠赠;宿主菌BL21(DE3)trxB－(Novagen产品)为复旦大学生命科学院葛晓春老师惠赠。

1.2 引物 上游引物 P1:5'－GCAGAATTCGGGCAGTTCAGAGTGATAGGA－3’，含EcoRI酶切位点;下游引物P2:5'－ ACATCTCGAGTCGGAAGAAGCAGGTGAAAC － 3’，含XhoI酶切位点。由上海生工合成。

1.3 主要试剂及设备 Trizol试剂盒、RT－PCR试剂盒(TaKaRa);Xho I、EcoRI限制性内切酶和T4 DNA连接酶、质粒抽提试剂盒及DNA纯化试剂盒(上海博彩生物有限公司);细胞培养用胰化蛋白胨及酵母提取物(Gibco－BRL);异丙基－β－D－硫代半乳糖苷(isopropyl－β－D－thiogalactopyranoside，IPTG)及咪唑(上海普飞生物技术有限公司);Ni－NAT His.Bind Resins(Novagen产品);丙烯酰胺、N，N＇－ 亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、过硫酸胺及 N，N，N＇，N＇－ 四甲基乙二胺(tetramethyl ethylene diamine，TEMED)(Sigma)，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie，EDTA);羊毛脂、液体石蜡、结核杆菌(H37Rv)及百日咳毒素(pertussis toxin，PT，Sigma)。高速匀浆机(上海标本模具厂)，台式低温冷冻离心机(Beckman)，空气浴振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂)，垂直电泳仪(Bio－Rad)。

1.4 动物 体重18－20 g、8－10周龄雌性 C57BL/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司);体重180－200 g白色豚鼠(温州医学院实验动物中心)，雌雄不拘。

2 方法

2.1 表达载体pET32a－MOGIgd的构建和鉴定 RT－PCR、酶切、连接及转化采用常规方法;采用试剂盒抽提质粒。应用限制性内切酶Eco RI及Xho I对重组质粒进行初步鉴定，再送上海申能博彩生物技术有限公司测序。

2.2 MOGIgd－TrxA融合蛋白与TrxA蛋白的表达及鉴定将筛选所得的重组质粒pET32a－MOGIgd及pET32a(+)转化大肠杆菌BL21－trxB－，分别涂LB/(50 mg/L氨苄青霉素、15 mg/L卡那霉素)琼脂板上，37℃培养12－16 h。挑阳性菌落分别接种3 mL双抗生素培养液试管中，培养过夜。各取1 mL菌液加入100 mL的双抗生素培养液中，37℃、250 r/min振荡至A600≈0.8，加入1 mol/L IPTG于30℃、250 r/min振荡5 h，收集菌体。部分菌体予渗透休克处理，离心后取上清及沉淀;部分菌体经超声粉碎、裂解液处理，离心后取上清及沉淀。行SDS－PAGE以确定是否有目的蛋白表达，目的蛋白以可溶性形式表达或以包涵体形式表达。

2.3 MOGIgd－TrxA融合蛋白与TrxA蛋白纯化 扩大体积诱导BL21－trxB－/pET32a－ MOGIgd菌及 BL21－trxB－/pET32a(+)菌表达。上一步实验证实MOGIgd－TrxA融合蛋白以包涵体形式表达，故通过分离包涵体粗提MOGIgd－TrxA融合蛋白，BL21－trxB－/pET32a－MOGIgd发酵液离心后弃上清，沉淀用 TE缓冲液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)悬浮，超声粉碎菌体15 s×6次，每次间隔20 s，裂解菌液离心后弃上清，沉淀即包涵体用0.9%生理盐水洗涤1次。包涵体经金属螯合亲和层析柱进一步纯化，上述包涵体加入结合缓冲液(8 mol/L urea;0.1 mol/L NaH2PO4;0.01 mol/L Tris－HCl，pH 8.0)打匀，离心留上清;取 Ni－ NAT His.Bind Resins，注入层析柱，结合缓冲液平衡后自然沉淀，接核酸蛋白检测仪，取波长280 nm;加样，反复打匀后自然沉淀，打开下阀门，出现第1峰直至恢复至基线，洗涤缓冲液(8 mol/L urea;0.1 mol/L NaH2PO4;0.01 mol/L Tris － HCl，pH 6.3)冲洗，洗脱液(8 mol/L urea;0.1 mol/L NaH2PO4;0.01 mol/L Tris－HCl，pH 4.5)洗脱，收集流出峰。TrxA蛋白以可溶性形式表达，通过渗透休克粗提TrxA蛋白，加入结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0;0.3 mol/L NaCl;10 mmol/L 咪唑，pH 8.0)上层析柱，洗涤缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0;0.3 mol/L NaCl;20 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗涤，洗脱液(50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0;0.3 mol/L NaCl;250 mmol/L咪唑，pH 8.0)洗脱，收集流出峰。

2.4 抗原制备及模型制作 将获得的MOGIgd－TrxA融合蛋白、TrxA蛋白和生理盐水分别与完全福氏佐剂(complete Freund＇s adjuvant，CFA)等体积混匀，制成油包水型乳剂。C57BL/6小鼠随机分为3组，MOGIgd－TrxA组(MOG组)、硫氧还蛋白组(TrxA组)及正常对照组(NC组)，12只/组，以相应抗原乳剂免疫小鼠制作EAE模型，采用Kono标准5分法［6］对小鼠进行临床功能评分。详细过程见李佳等［7］所述。

2.5 病理学观察 高峰期处死小鼠，取出脑、脊髓组织后制作石蜡切片，厚度为6 μm，同一部位同时切取2张切片，分别行苏木素－伊红(hematoxylin－eosin，HE)染色及髓鞘Luxol fast blue染色。

结 果

1 MOGIgd蛋白cDNA克隆、融合表达及纯化

1.1 表达载体 pET32a－MOGIgd的构建及鉴定 人脑总RNA进行RT－PCR，将322 bp目的基因片段回收后，利用引物上所带Xho I和EcoR I酶切位点将基因片段切出连入载体pET32a(+)中。双酶切后显示1条303 bp片段，见图1。进一步送上海博彩生物有限公司测序，结果显示与编码MOG1－100的碱基序列完全一致，表明MOGIgdcDNA已正确克隆到pET32a(+)载体中。

Figure 1.Restriction analysis of pET32a － MOGIgd.1:DNA marker;2:MOGIgdcDNA;3:pET32a－MOGIgd;4:pET32a－MOGIgddigested with XhoⅠand EcoR Ⅰ图1 pET32a－MOGIgd的酶切鉴定

1.2 MOGIgd－TrxA融合蛋白与TrxA蛋白的表达及鉴定携有重组表达载体pET32a－MOGIgd和pET32a(+)的大肠杆菌BL21－trxB－经IPTG诱导5 h后，菌体裂解物进行SDSPAGE分析。结果显示MOGIgd－TrxA融合蛋白位于约32 kD处，经灰度扫描分析显示表达量占菌体总蛋白的42%左右，并以包涵体形式存在;而无插入的pET32a(+)表达约21 kD的单体蛋白TrxA，经渗透休克释放于上清液中，见图2。

Figure 2.Expression of MOGIgd－TrxA fusion protein and TrxA protein in BL21(DE)trxB－.1:protein marker;2，3:pET32a－MOGIgdbacteria before induction and after 5－ hour induction，respectively;4，5:supernatant and pellet fractions from induced pET－MOGIgdbacteria after sonication，respectively;6，7:pET － 32a(+)bacteria before induction and after 5－hour induction，respectively;8，9:supernatant and sediment from induced pET －32a(+)bacteria after osmotic shock，respectively.图2 MOGIgd－TrxA融合蛋白和TrxA单体蛋白在BL21(DE)trxB－菌中的表达

1.3 MOGIgd－TrxA融合蛋白与TrxA蛋白纯化 经金属螯合亲和层析纯化后MOGIgd－TrxA与TrxA蛋白的纯度达95%左右，见图3。

Figure 3.Purification of MOGIgd－TrxA fusion protein and TrxA protein.1:protein marker;2:pET32a－MOGIgdinclusion body;3:flow through;4:purified MOGIgd－TrxA;5:supernatant of induced pET32a(+)bacteria after osmotic shock;6:flow through;7:purified TrxA protein.图3 MOGIgd－TrxA融合蛋白与TrxA蛋白纯化

2 MOGIgd－TrxA融合蛋白诱导EAE模型

2.1 临床症状及神经功能评分 发病小鼠多表现为尾部张力下降，后肢麻痹，弓背，全身震颤，体重下降(部分小鼠体重下降不明显)。MOG组小鼠发病率为75%(9/12)，于免疫后第(12.14±2.04)d发病，症状达峰时间为发病后(4.43±1.13)d，高峰期神经功能评分为(2.64±0.48)，随着观察期的延长，小鼠的病程呈慢性非缓解型，症状稍有波动。TrxA组和NC组小鼠无发病。

2.2 病理检测 HE染色发现，MOG组存在炎症浸润，炎症病灶主要累及脊髓实质、灰白质交界处、侧脑室周围及大脑皮髓质交界处以至深部白质等部位，受累部位表现为以单核细胞为主的炎症细胞浸润。髓鞘Luxol fast blue染色可见白质疏松，颜色淡染，局部斑片状髓鞘脱失，主要累及侧脑室旁、脑干、小脑等部位，见图4。TrxA组和正常对照组均无上述表现。

Figure 4.Confluent demyelination near the lateral ventricle of MOG group(Luxol fast blue staining，×400).图4 MOG组侧脑室旁脱髓鞘病灶

讨 论

MS是原发性中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病，临床表现为慢性复发性或慢性进展性病程，病理表现为炎性细胞浸润及髓鞘脱失。EAE是MS的经典动物模型，MOG主动免疫可诱导出慢性复发性EAE，伴有广泛的髓鞘脱失，与MS非常相似［1］。MOG最先由Linington等［8］于1984年用小鼠单抗8－18C5发现并命名，为特异性表达在中枢神经系统少突胶质细胞的膜结合蛋白，位于髓鞘结构的最外层。成熟的MOG由218个氨基酸组成，其胞外段含1个免疫球蛋白样可变结构域，具有多个T细胞和B细胞表位，有很强的免疫原性。MOG具有高度疏水性，且含量极微，仅占人类中枢神经系统髓鞘蛋白的0.05%－0.10%，所以从组织中纯化到足够量的MOG极为困难。目前主要通过人工合成的方法获得MOG肽段，运用最多的为MOG35－55，但合成肽段技术要求高，价格昂贵。本研究用分子克隆技术将MOG胞外段包括MOGIgd在内的第1－100位氨基酸的cDNA克隆到表达载体pET32a(+)中，在BL21(DE3)trxB－宿主菌中实现了融合表达，表达量占总菌体蛋白的42%左右。此法具有产量高、纯化方便的优势。

国外学者曾以多种原核表达系统表达MOG的胞外段，产物均形成包涵体［9，10］。我们所要表达的 MOGIgd预测分子量仅11 kD左右，等电点为9.14，含有1个二硫键。选择TrxA作为融合表达系统，是由于TrxA参与细胞内一些蛋白质的二硫键形成，可以帮助蛋白质正常折叠，从而产生有活性的可溶蛋白质，同时避免细胞膜内蛋白酶的降解。另外，多种TrxA融合蛋白质可以通过渗透休克从大肠杆菌中定量地释放出来，可用作初步纯化融合蛋白的有效手段［11］。pET32a(+)表达载体运用了经过改造的BL21(DE3)trxB－宿主菌，该菌内的TrxA还原酶被突变，更有利于二硫键的形成。令人遗憾的是，虽然采用改变温度、细胞密度及诱导剂的浓度等措施，但最终MOGIgd－TrxA融合蛋白仍以包涵体的形式表达，这可能与MOGIgd本身的化学结构有关。本研究通过超声破菌等处理获得包涵体，对MOGIgd－TrxA融合蛋白进行初步纯化。由于pET32a(+)载体在TrxA与目的蛋白之间插入组氨酸标签，此标签可与金属离子螯合，通过金属螯合亲和层析柱进一步纯化，获得纯度为95%左右的目的蛋白。

我们曾利用获得的MOGIgd－TrxA融合蛋白为包被抗原，成功检测MS患者血清和脑脊液中抗MOG抗体，证实其具有抗原性［12］。本研究证实MOGIgd－TrxA融合蛋白具有免疫原性，将其主动免疫C57BL/6小鼠，实验动物EAE的成模率为75%，呈慢性非缓解病程，病灶多发，累及脊髓、大脑半球、小脑及脑干，病理表现为以单核细胞为主的炎症细胞浸润及髓鞘脱失。TrxA组小鼠不管临床还是病理上均无类似表现，证明TrxA无免疫原性。

综上所述，本研究成功建立人MOGIgd的TrxA融合表达系统，通过较为简便的方法获得高产量、高纯度的MOGIgd－TrxA融合蛋白，MOGIgd融合蛋白具有免疫原性，可作为免疫原诱导EAE动物模型。

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