cPKCγ－HSP60信号通路参与小鼠脑低氧预适应*

蒋淑君， 张 楠， 李俊发

(1滨州医学院生理学教研室，山东烟台264003;2首都医科大学神经生物学系，北京100069)

脑中风等缺血性脑血管疾病已经和冠心病、恶性肿瘤等一并列为当今世界上严重威胁人类健康的三大杀手，尤其在我国，急性脑血管疾病的发病率及死亡率明显高于冠心病。据统计，2007年我国有600万人罹患中风，其中45%为脑缺血所致［1］。脑低氧预适应(hypoxic preconditioning，HPC)是一种内源性保护机制，即短暂、亚致死性的重复性低氧刺激可引起组织或器官对继发严重缺氧/缺血的耐受。其形成机制的研究，尤其是对参与HPC形成的细胞信号转导通路的研究，可为临床治疗脑缺血/低氧损伤开辟新思路。我们以往研究发现，常规型蛋白激酶Cγ(conventional protein kinase，Cγ，cPKCγ)的激活参与了脑HPC的发生发展过程［2］。同时我们也发现，HPC可能通过增加大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠皮层组织内cPKCγ等的膜转位水平，对缺血损伤起抑制作用［3］。然而究竟哪些蛋白可能与cPKCγ相互作用并参与该过程，至今仍不清楚。本研究拟利用小鼠整体HPC模型及蛋白质组学技术进一步鉴定HPC小鼠脑皮层组织内与cPKCγ相互作用的蛋白，并探讨与cPKCγ相互作用的热休克蛋白60(heat－shock protein 60，HSP60)表达水平在HPC及脑缺血过程中的变化。

材料和方法

1 材料

免疫沉淀试剂盒(Sigma－Aldrich)，蛋白酶抑制剂(亮肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素A、糜蛋白酶抑制素)、磷酸酶抑制剂(KF、冈田酸、Na2P2O7、原矾酸钠)、脂氧胆酸钠、DTT、NP －40、EDTA、EGTA 等试剂(Sigma Aldrich);兔源性cPKCγ多克隆抗体(Santa Cruz)，兔源性热休克蛋白(HSP)60抗体(Cell Signalling Technology)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体、山羊抗小鼠抗体和ECL反应底物(Chemicon);Gel Doc凝胶成像分析系统(Bio－Rad);BCA蛋白定量试剂盒(Pierce);11cm IPG预制干胶条(pH 3－10，线性，GE Healthcare);银染试剂盒(Amersham);Kodak BioMaxMR X－光胶片(Kodak)。

2 方法

2.1 动物及模型制备 健康BALB/c小鼠(雄性，体质量18－22 g，8－10周，SPF级，医学实验动物质量合格证书，许可证编号SCXK－(军)2009－004，首都医科大学动物部。按文献方法［4］，首先制备常氧(normoxia，Norm)和HPC组小鼠。低氧暴露结束后，室温恢复1 h，再进行MCAO缺血(ischemia，I)模型制备［5］，实验动物分为Norm组、HPC组、常氧假手术组(Norm+sham)、常氧缺血组(Norm+I)、HPC假手术组(HPC+sham)和HPC缺血组(HPC+I)，每组 n=6。

2.2 胞浆和膜相关蛋白的提取 参照文献［6］进行，将冻存Norm组和HPC组小鼠皮层组织按10 mL/g的比例加入裂解液A［mmol/L:Tris－HCl 50(pH 7.5)，EGTA 2，EDTA 2，DTT 2，Na4P2O75，KF 50，冈田酸5×10－5，高肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素 A、糜蛋白酶抑制素各 5 mg/L］，匀浆、超声破碎，4℃、30 000×g离心30 min，取上清液作为胞浆成分(cytosolic)保存;沉淀物再加入相同体积的裂解液B(匀浆液A+0.5%NP－40)，并进一步超声破碎，在4℃、30 000×g离心30 min，取上清液作为膜相关蛋白成分(particulate)。

2.3 免疫沉淀 取相应的蛋白质组分1 mg，加入2 μgⅠ抗，室温下置于摇床数小时，再加入protein GSepharose 4℃过夜。12 000×g离心1 min，弃去上清，沉淀用缓冲液洗数次，最后加入thiourea buffer(用于双向电泳)处理沉淀5 min，离心弃去沉淀，所得上清即为免疫沉淀产物。

2.4 双向电泳、银染及凝胶图像分析 第一向等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)采用固相化11cm IPG预制干胶条(pH 3－10，线性)，再水化同时上样。聚焦程序如下:30 V 12 h，step;200 V 1 h，step;500 V 1 h，step;1 000 V 1 h，step;8 000 V 1 h，gradient;8 000 V 3 h，step。IEF后IPG胶条从电泳槽中取出，分别在平衡液A和平衡液B中平衡15 min后转入预先灌制好的SDS－PAGE胶上进行第二向电泳，每面胶电流为15 mA，待溴酚蓝前沿至阳极约5 mm时停止电泳。固定电泳后的凝胶，按敏化、银染、显色和终止步骤依次进行凝胶的银染显色。应用Image Master 2D Platinum软件对凝胶进行分析。

2.5 胶内酶切和质谱鉴定 按文献［7］进行蛋白点的胶内酶解及 MALDI－TOF－MS(prOTOF 2000，PerkinElmer)检测，获得数据应用NCBInr和Swissprot数据库进行蛋白鉴定。

2.6 蛋白样品制备、SDS－PAGE和Western blotting参照文献［8］，抽提 Norm+sham 组 、Norm+I组、HPC+sham组和HPC+I组皮层缺血核心区、半影区和对侧皮层组织的全细胞蛋白组分，BCA法蛋白定量，－20℃保存备用。分别取50 μg各组蛋白样品进行蛋白电泳(10%SDS PAGE，4℃，20－30 mA)和转膜(PVDF膜，400 mA，3 h)。用cPKCγ抗体、HSP 60抗体和β－actin(内参照)抗体进行杂交。所得结果用Gel Doc凝胶成像系统扫描后分析。

3 统计学处理

实验数据处理和检验应用Quantity One分析软件进行半定量分析，并以均数±标准差(±s)表示。应用SPSS软件，首先进行单因素方差分析(One－way ANOVA)，然后进行Bonferroni检验。

结 果

1 HPC小鼠脑皮层膜相关成分中与cPKCγ相互作用差异表达蛋白HSP60的鉴定

采用相同上样量的Norm组和HPC组小鼠皮层与cPKCγ相互作用蛋白进行双向电泳，获得了较满意的电泳图谱，见图1。应用双向电泳图谱专业分析软件Image Master 2D Platinum对Norm组和HPC组小鼠皮层蛋白双向电泳图谱进行了比较分析，结合质谱鉴定我们发现，与常氧组比较，HPC小鼠脑皮层膜相关成分中，与cPKCγ相互作用的HSP60在膜相关成分中升高了(1.34 ±0.19)倍，n=3，见图2。

Figure 1.Representative 2D mapping of cPKCγ－interacted proteins in particulate fraction of cortex in normoxic(Norm)and hypoxic preconditioning(HPC)mice.Differentially expressed proteins were highlighted by arrows in silver－ stained 2D PAGE gels.In particular，from 1 to 15，they were transitional endoplasmic reticulum ATPase，aconitate hydratase，heat－ shock protein 70，heat－shock protein 60，synapsin，pyruvate kinase，ATP synthase，creatine kinase，phosphoglycerate kinase，purinerich element－binding protein A，fructose－bisphosphate aldolase A，guanine nucleotide－binding protein，14－3－3 protein gamma and ubiquitin carboxyl－ terminal hydrolase L1，respectively.图1 小鼠脑组织膜相关成分中与cPKCγ相互作用蛋白的典型双向电泳图

Figure 2. Protein expression of cPKCγ － interacted HSP60.Magnified pictures of 2－DE images showed an increase in HSP60 protein expression level in particulate fraction of cerebral cortex of HPC mice.图2 与cPKC γ相互作用的HSP60蛋白表达

2 免疫共沉淀验证差异表达的HSP60与cPKCγ相互作用情况

利用免疫沉淀发现，cPKCγ在膜相关蛋白成分中与HSP60存在相互作用。同时，在膜相关蛋白成分中利用HSP60的抗体也能沉淀出cPKCγ，见图3。

3 低氧预适应对MCAO小鼠皮层组织HSP60表达量的影响

Figure 3.The interaction between HSP60 and cPKCγ.cPKCγ was immunoprecipitated with HSP60 antibody in particulate and cytosolic fraction in HPC mice.WCL:whole－cell lysate;P:particulate;C:cytosolic.图3 HSP60和cPKCγ的免疫共沉淀结果

在MCAO诱导的缺血模型中，与Norm+sham组小鼠相比，Norm+I组及HPC+I组小鼠皮层缺血核心区HSP60表达水平明显升高(P＜0.05，n=6);与Norm+sham组小鼠相比，Norm+I组及HPC+I组小鼠皮层半影区HSP60表达水平升高(P＜0.05，n=6)。HPC+I组小鼠皮层缺血核心区HSP60表达水平低于Norm+I组(P ＜0.05，n=6)，而 HPC+I组小鼠皮层半影区与Norm+I组小鼠皮层半影区相比，HSP60表达水平有降低，但差异无显著，见图4。

Figure 4.Protein expression levels of HSP60 in ischemic cortex of MCAO mice.A:Western blotting results;B:quantitative analysis.S:sham;Ic:ischemic core;P:penumbra;C:contralateral area of occluded hemisphere.±s.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs Ic in Norm+I group.图4 脑缺血/预适应小鼠皮层组织HSP60蛋白表达

讨 论

HPC是机体的一种内源性保护机制，即亚致死性低氧刺激可激发组织器官产生对继发严重缺血/低氧性损伤的耐受。目前为止，人们已利用多种脑缺血模型证实了其保护作用。然而，HPC脑保护作用的确切机制仍不清楚。很多研究表明，腺苷及其受体和低氧诱导因子(hypoxia－inducible factor，HIF)等均参与了HPC的脑保护作用，并且在这些机制中均有PKC家族的参与。cPKCγ是PKC家族中最特殊和重要的亚型之一，其在组织中的分布局限于中枢神经系统，对于突触的形成以及可塑性的调节都具有极其重要的作用。许多研究表明，cPKCγ在脑I/HPC方面同样发挥重要作用。PKCs激活后可以发生移位，即从胞浆转移到胞膜、细胞骨架结构或细胞核内，称为膜转位。我们在小鼠整体HPC模型中也发现了cPKCγ的膜转位激活［6］，cPKCγ的激活可能参与了HPC减轻小鼠大脑中动脉阻塞所致脑缺血性损伤［3］。为了进一步揭示参与 HPC的cPKCγ信号网络，本研究利用蛋白质组学技术及整体HPC小鼠模型，发现低氧预适应可致小鼠皮层组织膜相关成分中与cPKCγ相互作用的多种蛋白的表达量发生明显变化，如HSP60、ATP synthase、creatine kinase、phosphoglycerate kinase 、14 －3 － 3 protein gamma、HSP70等，提示这些蛋白可能均参与了cPKCγ介导的脑低氧预适应形成。在新生心肌细胞PKC参与HSP介导的应激损伤保护作用［9］，在缺血预适应的肝脏，HSP表达受依赖PKC的P44/42信号通路调节［10］。我们通过双向电泳和质谱分析鉴定及免疫共沉淀证实，低氧预适应时在小鼠皮层膜相关成分中cPKCγ与HSP60存在相互作用。

HSP60家族属于热应激蛋白，热应激蛋白存在于所有的原核与真核生物中，在细胞内起“分子伴侣”的作用，可协助多肽或蛋白质的正确转位、折叠和装配，具有维持蛋白稳定、促进细胞生存等功能，在细胞生长、发育、分化、基因转录等方面发挥重要作用［11］。正常状态下HSP60主要以稳定状态存在于线粒体基质中，胞质内含量较少，在机体处于应激状态时可过表达或异位表达。因此，HSP60也被认为是反映线粒体应激和损伤程度的指标。近来的研究表明，低氧/缺血损伤可致新生大鼠脑皮质缺血区周围组织内HSP60蛋白量增高［12］。脑缺血损伤可使神经元内未折叠蛋白毒性堆积并导致神经细胞死亡，脑缺血所致的未折叠蛋白毒性堆积及线粒体应激可能引起HSP60 mRNA和蛋白表达水平增加［13］。本研究结果显示，在MCAO诱导的缺血模型中，小鼠皮层缺血核心区及半影区HSP60表达水平较假手术组均明显升高，而低氧预适应后缺血核心区HSP60表达水平降低，提示神经细胞在缺血/低氧状态下未折叠蛋白毒性堆积及线粒体应激致HSP60表达增高，低氧预适应可能通过调节HSP60蛋白表达，起到一定的脑保护作用。

本研究借助蛋白质组学与整体HPC小鼠模型证实，cPKCγ可能通过HSP60参与脑低氧预适应的形成。进一步通过HPC结合MCAO小鼠模型发现，在脑缺血缺氧损伤时HSP60蛋白表达水平明显升高，低氧预适应后HSP60蛋白表达有所降低。以上结果揭示cPKCγ－HSP60信号通路参与脑低氧预适应过程，cPKCγ可能通过调节与其相互作用蛋白HSP60在低氧/缺血损伤和预适应中发挥着重要作用。然而，其相互作用机制及在脑缺血/低氧损伤中如何发挥作用等均有待进一步研究。

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