氨基胍对人翼状胬肉成纤维细胞增殖影响的体外试验研究

林 智

（海口市琼山区人民医院眼科，海口市 571100）

氨基胍对人翼状胬肉成纤维细胞增殖影响的体外试验研究

林 智＊

（海口市琼山区人民医院眼科，海口市 571100）

目的：观察氨基胍（AG）对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响。方法：取人翼状胬肉标本进行体外贴壁细胞常规培养，传代至第3～5代细胞用于试验，以每孔1×104个细胞接种于培养板中，加入不同浓度（250、500、750、1000μmol·L－1）的AG作为AG组，另设不加AG的为对照组，检测作用24、48、72h后各孔的吸光度，并计算细胞增殖抑制率，每个时间点、每个浓度均设6个复孔。结果：人翼状胬肉成纤维细胞增殖抑制率随AG浓度的增大和作用时间的延长明显升高（P＜0.05）。结论：AG在受试浓度和受试时间范围内，对体外培养的人翼状胬肉成纤维细胞具有抑制作用且呈浓度、时间依赖性。

人翼状胬肉；成纤维细胞；氨基胍；细胞增殖抑制率；体外试验

翼状胬肉是局部球结膜纤维血管组织增生侵犯角膜的一种疾病，其发病机制尚不完全明确[1]。病理学研究表明，翼状胬肉的主要成分是异常增生的成纤维细胞，并因其导致的相应病变，此基本病变与多种纤维增生性疾病有相似之处[2]。近年研究[3]表明，氨基胍（AG）作为诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂，对体外培养的肺成纤维细胞有抑制作用。本试验通过在体外培养人翼状胬肉成纤维细胞（HPF），观察AG对HPF增殖的影响，为探讨翼状胬肉的发病机制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HERAcell 150型CO2培养箱（德国Heraeus公司）；Sunrise型酶标仪（奥地利Sunrise公司）；Ⅸ71型倒置相差显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 试药

AG（美国Sigma公司，批号：396494，超级纯）；胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）（美国Amresco公司，超级纯）；二甲基亚砜（DMSO，研域（上海）化学试剂有限公司，批号：0603174，优级纯）；小牛血清（特优级）、RPMI 1640培养基（超级纯）（美国Gibco公司）。

1.3 组织标本

20例原发性翼状胬肉患者，于我科门诊行翼状胬肉切除术，男12例，女8例，年龄32～54岁。人翼状胬肉组织标本取材均为鼻侧脸裂部近角巩膜缘球结膜组织。

2 方法

2.1 细胞培养

将人翼状胬肉组织标本，在超净工作台上剪成约1.0mm3的组织块，均匀接种于培养瓶底，待组织块贴壁后加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中，2～3d换液1次，待细胞覆盖瓶底80%后用0.25%的胰蛋白酶消化传代。传代时采用差速贴壁法进行细胞的分离和纯化，SABC（Strept avidin-biotin complex）免疫组化染色法进行波形丝蛋白、角蛋白染色，确认为成纤维细胞后，取第3～5代细胞用于试验[4]。

2.2 成纤维细胞增殖抑制率检测

HPF细胞传代至第3～5代，将处于对数生长期的HPF细胞，以每孔1×104个的浓度接种于96孔培养板上，每孔加液200μL，再加入不同浓度（250、500、750、1000μmol·L－1）的AG作为AG组，另设不加AG的作为对照组，分别于作用24、48、72h时每孔加入浓度5g·L－1MTT 20μL－1，培养4h，小心吸净培养液，每孔加入DMSO 150μL，振荡溶解10min，待结晶完全溶解后，在酶标仪上，490nm波长处，测定各孔吸光度（A），并计算细胞增殖抑制率，每个时间点、每个浓度均设6个复孔。细胞增殖抑制率＝（1－AG组A值/对照组A值）×100%[5]。

2.3 统计学处理

采用SPSS 12.0软件进行数据处理，数据以±s表示，2组间比较采用两样本t检验，P＜0.05表示具有显著性差异。

3 结果

结果表明，AG对体外培养的HPF增殖具有抑制作用，在0～1000μmol·L－1浓度范围及24～72h时间范围内，呈剂量、时间依赖性，且具有显著性差异，具体详见表1。

表1 不同浓度AG作用不同时间对HPF增殖的影响Tab1 Inhibition rate of human pterygium fibroblast proliferation by different concentrations of AG after different period

4 讨论

翼状胬肉是一种组织增生性疾病，其细胞异常增殖和凋亡，与肿瘤细胞有相似之处。其形成、发展和术后复发都需要新生血管化的参与。颜美荣等[6]研究证实，iNOS在翼状胬肉中表达增强，与翼状胬肉的发生、发展有一定关系。本研究选择iNOS抑制剂AG[7]，观察不同浓度的AG对HPF增殖的影响。结果表明，AG对HPF增殖有明显的抑制作用，分析原因可能是：（1）翼状胬肉并非肿瘤，但具有肿瘤类似的特点，细胞能异常增殖和凋亡；（2）翼状胬肉向角膜发展侵袭的必备条件是新生血管的形成；（3）AG抑制了iNOS，从而抑制了新生血管壁成纤维细胞的增生。

[1] 赵春明，张明昌，晏雪莹，等.β-NGF对人翼状胬肉成纤维细胞增生的影响[J].眼科研究，2009，27（11）：955.

[2] 莫百军，王映芬，蔡康荣，等.蝮蛇抗栓酶对人翼状胬肉成纤维细胞增殖效果的影响[J].眼视光学杂志，2005，7（1）：30.

[3] 孙玉敏，张丽萍.AG对大鼠纤维化肺成纤维细胞表达CTGF的影响[J].陕西医学杂志，2009，38（5）：541.

[4] 罗 艳，黄艳明，刘恒明.转化生长因子β2抗体对体外培养人翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响[J].医药导报，2008，27（10）：1176.

[5] 蒋 丽，张明昌.NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸对人翼状胬肉成纤维细胞增殖的影响[J].国际眼科杂志，2007，7（1）：86.

[6] 颜美荣，李正贤，刘庚勋，等.诱导型一氧化氮合酶在翼状胬肉中的表达及其意义[J].临床军医杂志，2007，35（2）：183.

[7] 李强翔，李 玮，谢小英，等.氨基胍和维生素C对糖尿病肾病模型大鼠血清层粘连蛋白的影响[J].中国药房，2005，16（23）：1776.

Effect of Aminoguanidine on the Proliferation of Human Pterygium Fibroblast in Vitro

LIN Zhi
（Dept.of Ophthalmology，Haikou Qiongshan District People’s Hospital，Haikou 571100，China）

OBJECTIVE：To observe the effect of aminoguanidine（AG）on the proliferation of in vitro cultured human pterygium fibroblast.METHODS：Human pterygium specimens were obtained to conduct normal in vitro-culture of adherent cells and use the 3～5generation cells for experiment.1×104cells were inoculated in each well of culture plate supplemented with different concentrations of AG（250，500，750，1000μmol·L－1）as AG group.Other culture plate weren’t supplemented with AG as control group.The absorbency of each well were detected on 24，48，72h.The inhibition rate of cell growth was detected.6reduplicate wells of each time point and each concentration were established.RESULTS：With the concentration of AG increasing and acting time delay，the inhibition rate of human pterygium fibroblast growth increased significantly（P＜0.05）.CONCLUSION：In a certain range of concentration and time，AG have inhibited the proliferation of in vitro cultured human pterygium fibroblast in concentration and time-dependent manner.

Human pterygium；Fibroblasts；Aminoguanidine；Inhibition rate of cell growth；In vitro test

＊主治医师。研究方向：白内障、青光眼及眼表疾病。电话：0898-36651367。E-mail：454021106@qq.com

R777.33；R969

A

1001-0408（2011）17-1558-02

2010-11-17

2011-01-10）