儿童遗传性出凝血紊乱VWF FV GP1Bα基因研究

蒋玉凤，罗建明

(1.广 西 医 科 大 学 研 究 生 院， 广西 南宁 530021 2.广西医科大学第一附属医院儿科，广西 南宁 530021)

遗传性出凝血紊乱除了凝血因子缺乏外还包括血管性血友病因子(von Willeb rang factor，VWF)质或量的异常、血小板膜糖蛋白异常、五因子莱顿(factorV Leiden)突变、ADAMTS13、抗凝血酶、凝血素、蛋白 C或S缺乏等参与血液凝集的因素。儿童出凝血功能紊乱主要以先天性或遗传为主，其根本的发病机制就是相关基因的变异引起相应的凝血或抗凝血因子缺乏。近年来有报道称在中东部国家及印度南部除了常见的FⅧ、FⅨ缺乏外，FⅤ、FⅦ等缺乏也不少见，Pier Mannuccio Mannucci、Stefano Duga等科学家通过调查研究意大利及伊郎两个国家的1103例隐性遗传凝集紊乱病人已得到证实［1］;此外，近年来西方学者认为血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)发病率已高达1.3%［2］其发病率已超过血友病A占据首位。随着近年来出凝血分子生物学的研究表明某些基因变异可导致血管内微血栓形成，如五因子莱顿突变(factorV Leiden)、血小板膜糖蛋白 α(GP1Bα)、ADAMTS13缺陷、以及参与凝血的VWF基因突变，如28外显子A1区变异所致的2B型VWD［3，4］等。近年来发现一些不明原因出血以及虽诊断为ITP但经ITP治疗效果不佳而经抗凝治疗能取得较好疗效的儿科病人在临床所见不少，在这些病人中是否存在VWF、FⅤ、GPⅠba基因变异而导致出凝血功能紊乱呢?本文就此对2009年3月至2011年1月所收集的不明原因出血及ITP经常规治疗不佳而经抗凝治疗能取得较好疗效的门诊及住院病人行FV、VWF及GPⅠba基因进行研究，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象:收集2009年3月至2011年1月在我院儿科门诊及住院部就诊的不明原因出血，以及虽然临床诊断为ITP，按ITP治疗无效而经抗凝治疗能取得较好的效果病例共31例，其中男13例女18例，平均年龄3.8岁。

1.2 方 法

1.2.1 标本采集与DNA提取:收集患儿外周静脉血ACD抗凝，采用广州东盛生物科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒按试剂盒提取DNA。

1.2.2 引物设计:采用 Primer及 Oligel软件对VWF28真基因进行特殊引物设计［5］，以及对FV10、GPⅠba DNA序列进行引物设计，具体引物见表1。

表1 VWF28、GPⅠba、FV10基因特异性引物序列、退火温度及产物长度

1.2.3 聚合酶链反应(PCR):反应体系为50μL，反应在多通道PCR仪(PTC－220，美国MJ公司)上进行，95℃预变性4min;95℃变性45s;退火温度见表1，45s;72℃延伸45s;总共32循环最后延伸10min。

1.2.4 PCR扩增产物的鉴定及DNA测序结果判读:所有基因扩增后均经电泳后于凝胶电泳成像分析仪下观察，呈现清晰、明亮、无拖尾的条带并以DNA marker为参照，所扩增的产物均为所需目的条带，见图(1、2)。经PCR扩增成功的产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，并与GenBank中的正常序列进行Blast比对;VWF变异位点在国际VWF数据库(http://www.vwf.group.shef.ac.uk/index.html)查询;GPⅠba及 FV基因变异位点在(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)查询。

图1 第1、2、3泳道为VWF28、第4泳道及图2第5泳道为FVF10PCR产物电泳结果

图2 第1、2、3、4泳道为GPⅠba基因电泳结果

2 结果

所有病人VWF28、FV10及GPⅠba基因均成功扩增并测序，均未发现有意义的异常变异，在此实验中所发现的基因突变类型经证实均为多态性位点(见表2)。在此研究中发现1例病人VWF28存在V1229I变异;1例病人GPⅠba基因存在T119S变异。为了排除多态性我们用同样的方法对100例正常人进行了等位基因测序分析，发现各有2、3例正常人存在同样的突变，由此推测为少见的多态性位点。

表2 31例患儿VWF28、GPⅠba、FⅤ10基因突变类型频率

3 讨论

在发展中国家遗传性出凝血紊乱依然是影响人们生活质量的疾病之一，由于经济文化较落后大部分病人都得不到有效的诊断与治疗，甚至导致残疾。生活质量严重降低，为家庭及社会带来了沉重的负担。我国有关学者统计1983年至2002年在北京大学就诊的1312例出血凝集紊乱病人，其中血友病占89.8%、血管性血友病占5.1%、诊断不明确的凝集紊乱占1.7%。且大部病人出现出血症状的中位年龄都在婴幼儿时期，遗憾的是大部病人确诊的中位年龄都在10岁以后［6］。从本研究所收集的病例中出现症状的患儿平均年龄3.8岁，最小2月，与文献［4］所报道的初次发病的年龄相仿。本研究还发现很大部分病人在出现较严重的症状前已有鼻出血或皮肤粘膜易出现瘀斑、瘀点现象，而往往在感冒发热后病情加重而入院，这可能与外环境因素打破了出凝血平衡有关。值得提出的是由于大部病人在出现较严重的出血症状而就诊，而一些只有轻型出血的病人往往被家长及医生疏乎而漏诊，比如I型VWD占所有VWD的75%且绝大部分只有轻至中度的皮肤粘膜出血［7］。我国相关学者2003年在国际上所发表的论文［6］所统计的VWD仅占出血凝集紊乱的1.7%，远少于血友病89.8%的发病率，这与如今西方大部分学者已认为VWD是最常见的遗传性出血性疾病且发病率已超过血友病A而居首位［2］完全不同。这可能与我国经济及医疗水平较落后有关。从本文研究结果中得出，31例病人中未被检出VWF基因变异，这可能与收集的标本量太少或只是对VWF28外显子扩增，由此对于一些在VWF基因全长均可发生变异的VWD漏诊，鉴于近年来西方学者对VWD的大量报道，值得我们对其进行学习及研究。

VWF是一种大分子糖蛋白，最先发现的变异在VWF基因28外显子上，72%的变异位点都可在28外显子上找到(http://mmg2.im.med.umich.edu vWF)。在本研究中就此仅对VWF基因第28外显子扩增测序，发现1例病人存在V1229I变异，经查阅VWF国际数据库发现在1998年及2007年分别在意大利、加拿大发现此同样位点V1229G变异而导致1型VWD。经过对照研究，结果得出此位点为多态性位点，其发生率为2%。此外在VWF28外显子发现的T1381A、D1472H、V1565L三个位点的突变均为多态性位点其发生频率与国际VWF数据库登记的频率相仿。

初期止血的基本过程为当血管壁破损后血小板在大分子糖蛋白VWF因子帮助下其A1区与血小板GPⅠb受体结合完成初期止血功能，如血小板膜糖蛋白GPⅠb异常则会导致血小板粘附功能异常而出血。最常见的血小板型血管性血友病以GPⅠba基因突变为特点［8］。在本研究中54.8%的病人为诊断ITP但经ITP治疗无效而适当口服抗凝药却能取得较好的疗效，为此对本研究所收集的患儿都进行了有可能导致血管内微血栓形成的常见因子如VWF、GPⅠba、Fⅴ、进行基因研究，结果未发现异常突变，这有可能与所收集的病例数不够或本身VWF、GPⅠBA、FⅤ基因发生异常变异机率非常小有关［9］。除此之外，ADAMTS13、抗凝血酶、凝血素、蛋白C、蛋白S缺陷也成为血管内微血栓形成的因素［10］，但由于基金原因未对上述基因进行研究有待以后相关学者对此展开更深入的研究。

［1］Pier Mannuccio Mannucci，Stefano Duga an，Flora Peyvandi.Recessively inherited coagulation disorders［J］.Blood，2004，104(5):1243－1252.

［2］Mannucci PM，Federici AB，James AH，et al.von Willebrand disease in the 21st century:current approaches and new challenges［J］.Haemophilia，2009，15(5):1154 －1158.

［3］Bertina RM，Koeleman BP，Koster T，et al.Mutation in blood coagulation factorⅤassociated with resistance to activated protein C［J］.Nature，1994，369:64 －67.

［4］Fressinaud D，Mazurier C，Meyer D.Molecular Genetics of Type 2 von Willebrand disease［J］.Hematol，2002，75(1):9－18.

［5］Yukihiro Satoh M D，Hiroto Kita M D，Ken Kihira M D，et al.Gastrointestinal Angiodysplasia in a patient with Type2 von Willebrands disease and Analysis of Exon 28 of the Von Willebrand Factor Gene［J］.Gastroenterol，2004，99(12):2495－2498.

［6］Zhang L，LI H，Zhao H，et al.Retrospective analysis of 1312 patients with haemophilia and related disorders in a single Chinese institute［J］.Haemophilia，2003，9(6):696 －702.

［7］The National Heart，Lung and Blood Institute.The Diagnosis，Evaluation and Management of Von Willebrand Disease，Bethesda，MD:Bethesda，MD:National Institutes of Health Publication 08 － 5832.2007［J］.httpwww.nhlbi.nihgov/guidelines/vwd.

［8］马丽，周光纪.巨型血小板综合征与血小板型血管性血友病［J］.国外医学输血及血液学分册，2000，23(2).

［9］Sajid R，Khalid S，Mazari N，et al.Clinical audit of inherited bleeding disorders in a developing country［J］.Indian pathol Microbiol，2010，53(1):50 －53.

［10］Westrick RJ，Ginsburg D.Modifier genes for disorders of thrombosis and hemostasis［J］.Thrombosis and Hemostasis，2009，7(1):132 －135.