宫颈鳞癌患者人乳头瘤病毒感染和治疗后转归情况分析

王 洁，曹海霞，马 蓉，王 卓，吴建中

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率和死亡率一直居高不下。据统计，每年约有50万新发病例，其中80%发生在发展中国家。我国宫颈癌患病率和死亡率均约占世界的1/3，每年新增宫颈癌患者13.15万，约有5万例死于宫颈癌。大量研究证实，人乳头瘤病毒(human papillom avirus，HPV)与宫颈癌变的发生密切相关，持续性高危型HPV感染是发展为宫颈癌的必然因素[1]。目前，已发现的HPV基因亚型有100多种，其中超过1/3可以特异性感染肛门生殖器，并且具有地域差异性，在不同国家和地区HPV感染率和亚型分布不同[2]。了解宫颈癌患者HPV不同亚型的分布特点有助于为宫颈病变的预防提供重要依据，也为HPV疫苗的研发和临床使用奠定了基础。本研究采用实时荧光PCR技术对228例确诊宫颈鳞癌患者进行高危型HPV检测，探讨高危型HPV感染与宫颈鳞癌的关系及亚型分布特点。同时，对其中59例患者进行跟踪随访，分析不同治疗方案对HPV感染转归的影响,从而为宫颈癌治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年10月—2011年6月在我院住院治疗并经病理检查确诊为宫颈鳞癌患者228例，年龄24～79岁。将患者分为6个年龄组，其中<30岁6例，30～39岁27例，40～49岁79例，50～59岁66例，60～69岁35例，≥70岁15例。所有患者治疗前均进行HPV基因分型检测。随访患者于治疗后1个月和3个月时分别再次进行HPV基因分型检测。

1.2 标本收集和DNA抽提

1.2.1 标本收集 用无菌生理棉球洗去宫颈外分泌物，将棉拭子伸入宫颈管内鳞状上皮交界处采样，旋转3～4圈，停留数秒，以取得宫颈分泌物或脱落细胞。将取样后的棉拭子放入加有专用细胞保存液的取样管中，充分漂洗。每份标本取1 mL待检，余-20℃冻存。

1.2.2 DNA抽提 将1 mL待检标本置1.5 mL离心管中，1 000 rpm离心5 min，弃上清，PBS洗涤2遍，采用试剂盒抽提患者宫颈脱落细胞DNA(QIAamp DNA Mini Kit/QIAamp Blood Kit，QIAGEN，Germany)，操作方法按试剂盒说明书进行。

1.3 HPV基因分型定量检测

1.3.1 HPV基因分型和扩增 采用双通道实时荧光定量PCR检测方法，同时对HPV16、18、45、31、33、52、58、67型DNA进行分型定量。操作方法按照试剂盒说明书(Realquality RQ-HPV HR,AB ANALITICA,Italy)进行。

1.3.2 PCR扩增条件 将混合好的PCR反应液在ABI-7300荧光定量PCR仪上进行基因扩增检测，95℃预变性3 min后，以94℃变性15 s,57℃延伸40 s扩增40个循环。根据标准品建立标准曲线，由ABI-7300系统软件自动计算待测样品中HPV DNA拷贝含量。

1.4 治疗方法[3]

1.4.1 化疗 选用PVB化疗方案，采用深静脉插管化疗，予DDP 60～80 mg d1静脉滴注，VCR 1 mg d1静推，BLM 15 mg d1肌肉注射，3～4周重复，共2～4个疗程。根据患者的耐受性，决定化疗的疗程数。

1.4.2 放射治疗 予15 MV X线或60Co盆腔前后野垂直外照射，盆腔中线平面剂量DT 45～50 Gy，常规分割放疗1.8～2 Gy/次，部分患者给2/3量后予中挡铅盆腔四野照射。后装采用192Ir selectron 后装治疗机，A 点6～7 Gy/周，总量25～35 Gy。对于宫旁侵犯严重、病灶消退不满意者，局部缩野剂量增加6～8 Gy。

1.5 统计学分析

采用卡方检验进行统计学分析，应用SPSS 17.0软件进行数据处理，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染阳性率

228例宫颈鳞癌患者中HPV感染者共200例，HPV总阳性率为87.7%。其中HPV16阳性150例，占65.8%，HPV33/52/58/67阳性59例，占25.9%，HPV18/45阳性20例，占8.8%，HPV31阳性14例，占6.1%。各年龄组患者HPV阳性率分别为：<30岁83.3%(5/6)，30～39岁77.8%(21/27)，40～49岁89.9%(71/79)，50～59岁93.9%(62/66)，60～69岁82.9%(29/35)，≥70岁80.0%(12/15)，差异无统计学意义(P=0.238，见表1)。

表1 HPV主要基因型感染与年龄分布

2.2 各年龄组HPV16阳性率

150例HPV16阳性患者中，<30岁5例，30～39岁19例，40～49岁57例，50～59岁42例，60～69岁23例，≥70岁4例。各年龄组HPV16阳性率分别为：<30岁83.3%(5/6)，30～39岁70.4%(19/27)，40～49岁72.2%(57/79)，50～59岁63.6%(42/66)，60～69岁65.7%(23/35)，≥70岁26.7%(4/15)，差异有统计学意义(P=0.030，见表1)。

2.3 各年龄组HPV33/52/58/67阳性率

HPV33/52/58/67次要高危型阳性患者共59例，其中<30岁1例，30～39岁4例，40～49岁12例，50～59岁11例，60～69岁19例，≥70岁12例。各年龄组HPV33/52/58/67阳性率分别为：<30岁16.7%(1/6)，30～39岁14.8%(4/27)，40～49岁15.2%(12/79)，50～59岁16.7%(11/66)，60～69岁54.3%(19/35)，≥70岁80.0%(12/15)，差异有统计学意义(P=0.000，见表1)。

2.4 治疗后HPV感染的转归

在59例获随访的HPV阳性患者中有24例(40.7%)治疗后1个月转阴，41例(69.5%)治疗后3个月转阴。将患者按照治疗方法分为2组，其中放化疗联合治疗组31例，单纯放疗组28例。患者治疗后1个月HPV感染转阴人数分别为：放化疗联合组14例，占45.2%，单纯放疗组10例，占35.7%。治疗后3个月HPV感染转阴人数增加，分别为：放化疗联合组24例，占77.4%，单纯放疗组17例，占60.7%。在放化疗联合治疗组中共有7例患者HPV感染未转阴，其中4例病毒载量下降，2例同时感染HPV16和HPV33/52/58/67，前者病毒载量下降，后者病毒载量上升；1例感染HPV16，治疗后病毒载量上升。在单纯放疗组中有11例HPV感染未转阴，其中5例病毒载量下降，3例同时感染HPV16和HPV33/52/58/67，前者病毒载量下降或转阴，后者病毒载量上升；1例治疗前同时感染HPV16和HPV31，治疗后HPV16和HPV31病毒感染转阴，但HPV33/52/58/67转阳；1例感染HPV16和HPV33/52/58/67，治疗后前者病毒载量上升，后者病毒载量下降；1例治疗前仅感染HPV16，治疗后HPV16病毒载量下降，HPV33/52/58/67转阳。

3 讨论

HPV是一种嗜上皮性双链环状DNA病毒，在人和动物中分布广泛，能够特异性感染皮肤和黏膜。流行病学研究表明，HPV感染与宫颈病变密切相关，根据病毒致病性差异分为低危型HPV(LR-HPV，包括6,11、 40、42、 43、 44、54、61、70、72、51 型)和高危型HPV(HR-HPV，包括16、18、31、33、35、39、43、51、52、56、59、68、73、82 型)。LR-HPV主要引起尖锐湿疣和宫颈上皮内瘤变，而HR-HPV的持续感染被认为是宫颈癌发生的重要原因。

本研究选取了228例宫颈鳞癌患者，采用实时荧光定量PCR法进行基因分型检测。结果表明HPV总阳性率为87.7%，其中HPV16占65.8%，HPV33/52/58/67占25.9%，HPV18/45占8.8%，HPV31占6.1%，提示宫颈鳞癌与HPV感染密切相关，且大部分与HPV16亚型有关，与国外文献报道一致[4-5]。实验中HPV次要高危型33/52/58/67阳性患者明显多于HPV18/45亚型患者，与部分文献报道有悖，我们认为此为HPV亚型分布的人群差异性和地区特异性导致。将患者分为6个年龄组分别探讨不同年龄段患者HPV感染情况和亚型分布，发现HPV感染阳性率在各年龄段之间无差异(P>0.05),提示HPV感染是各年龄段宫颈癌患者共同的致病因素。当分别研究患者HPV16和HPV33/52/58/67阳性率时，我们发现各年龄组间差异显著，具有统计学意义。HPV16阳性患者大都为70岁以下，70岁以上患者中仅26.7%(4/15)为阳性。相反，HPV次要高危型33/52/58/67感染则易见于高龄患者中，60岁以上患者中此亚型阳性率显著增加，在70岁以上患者中高达80.0%(12/15)。结果提示在宫颈鳞癌患者中HPV亚型分布可能与年龄相关。由于本研究资料样本数偏少，特别是30岁以下和70岁以上年龄组，因此还需进一步研究证实。

在对59例随访患者研究中我们发现40.7%的HPV感染阳性患者治疗后1个月转阴，69.5%的HPV感染阳性患者治疗后3个月转阴，提示HPV对宫颈癌治疗敏感，在随访中具有一定意义。本院既往研究认为，对中晚期宫颈癌行PVB或PF方案同步放化疗可提高患者生存率，因此我们根据治疗方法将随访患者分为放化疗联合组及单纯放疗组，探讨不同治疗方案对HPV感染转归的影响。结果表明患者治疗后1个月HPV感染转阴人数分别为放化疗联合组14例，占45.2%；单纯放疗组10例，占35.7%。治疗后3个月HPV感染转阴人数分别为：放化疗联合组24例，占77.4%；单纯放疗组17例，占60.7%。统计学分析两者差异无统计学意义(P>0.05)。我们考虑与样本量和随访时间有关，增加样本数量，延长随访时间有利于进一步研究。在HPV感染未转阴的18例患者中有9例表现为病毒载量的下降，提示治疗有效果。另外9例病毒载量不同程度上升，其中8例为多重感染，最常见的是HPV16合并HPV33/52/58/67感染，说明多重感染可能影响了治疗效果，且与宫颈癌的不良预后有关[6]。

自WHO于1992年宣布HPV是引起宫颈癌变的首要因素以来,宫颈癌已成为了目前唯一病因明确的肿瘤。近年来，随着HPV检测技术的不断提高和人们对HPV在宫颈癌中作用的不断探讨，高危型HPV的感染逐渐成为了宫颈癌早期诊断和预后判断的重要指标之一。我们的研究进一步证实了高危型HPV感染与宫颈癌变有关，同时还表明在高龄患者中更易出现HPV次要高危型33/52/58/67感染阳性，提示HPV亚型分布存在年龄差异性，为HPV疫苗的研发和应用奠定基础。此外，在对随访患者HPV检测中我们认为宫颈癌的不同治疗方法对于HPV感染的转归也可能存在一定影响，多重感染有可能与宫颈癌的疗效预后相关。虽然目前尚无明显证据证明不同HPV亚型之间的相互作用会加强宫颈癌的病理作用,但多重感染在疾病进程中依旧是一个重要的宿主因素，有可能成为一个独立的预后指标，提示在宫颈疾病的治疗中应高度重视多重感染的发生。

[1]Cutts FT,Franceschi S,Goldie S,et al.Human papillomavirus and HPV vaccines [J].Bulletin of the World Health Organization,2007,85(9):719-726.

[2]Clifford GM,Smith JS,Plummer M,et al.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta analysis[J].Br J Cancer,2003,88(1):63-73.

[3]黄健,叶劲军,陆谔梅.化疗和放疗联合治疗中晚期宫颈癌疗效分析[J].癌症进展杂志,2008,6(2):181-184.

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