TDGF-1基因下调对人鼻咽癌细胞生长迁移侵袭的影响

沈 荣，龚丹丹，范 钰

畸胎瘤衍生生长因子-1(teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)基因是一种自分泌型的肿瘤生长因子，是表皮生长因子家族重要成员之一，该基因定位于人类染色体3p21.3[1]，编码Cripto蛋白。有研究发现，TDGF-1基因在许多恶性实体瘤如乳腺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、阴茎癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈过度表达，而其在正常组织中都不表达或低表达[2-3]，TDGF-1基因与大肠癌、乳腺癌的侵袭有关[4-7]。但目前在国内关于该基因在人鼻咽癌中作用的研究甚少[8]。为此，本研究借助于RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，以化学合成的TDGF-1基因小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染处理人鼻咽癌CNE-2细胞，观察TDGF-1 基因siRNA转染对癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料来源

人鼻咽癌CNE-2细胞，购自美国ATCC公司。TDGF-1基因siRNA正义链为5′- UUCGGCCUCGGUCUUCCCATT-3′，反义链为5′- UGGGAAGACCGAGGCCGAATT-3′。TDGF-1抗体购自美国Santa Cruz公司。TRIzol、RNase inhibitor、逆转录酶SSRTⅡ、Taq酶和转染试剂LipofectamineTM2000均购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染处理

人鼻咽癌CNE-2细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(Gibco公司)、37℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。转染前1天，将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板，1mL/well，培养过夜。次日进行转染。基本操作按说明书进行。细胞分组：(1)空白对照组(Con-A)为未经任何处理的鼻咽癌细胞；(2)空载对照组(Con-B)为即脂质体对照组；(3)siRNA组为10%胎牛血清的L-15培养液中含不同浓度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)的已用LipofectamineTM2000包埋的siRNA。转染后于不同时间采用胰酶消化收取细胞，再进行以下试验。

1.2.2 鼻咽癌细胞TDGF-1基因检测

1.2.2.1 mRNA水平 采用荧光实时定量PCR检测。收集细胞，以TRIzol抽提细胞总RNA,取总RNA 1 μg，以oligo dT(15 mer)为引物逆转录合成cDNA第一链，以此cDNA链2 μL为模板进行PCR扩增，步骤参照说明书进行。TDGF-1定量PCR引物为上游：5′-CAATTCGGCCTCGGTCTTC-3′；下游：5′-TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT-3′。FAM探针：5′-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3′ -TAM RA。以3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)为内参。PCR反应条件为：95℃，预变性3 min，95℃，30 s；52℃，45 s；72℃，45 s；35 个循环后，72℃再延伸7 min。

1.2.2.2 蛋白水平 参照文献[9]的方法，采用蛋白质印迹法方法检测。提取对照组和各实验组细胞总蛋白，蛋白定量后进行常规蛋白质印迹法检测,将硝酸纤维素膜进行扫描或拍照。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software (Eastman Kodak Company,USA) 测定条带净灰度值，与内参照β-actin的测定结果相比较，并计算比值。

1.2.2.3 软琼脂集落形成试验 参照文献[10]的方法，进行软琼脂集落培养试验，观察TDGF-1 siRNA转染对鼻咽癌细胞锚着不依赖性增殖的影响。

1.2.2.4 体外癌细胞迁移试验 采用划痕试验检测癌细胞的迁移能力。将所有细胞接种于6孔板，以含10%胎牛血清的L-15培养液培养至细胞将近长满，换无血清L-15培养液培养24 h后，以1 mL移液器吸头在细胞层仔细划痕，以PBS洗两遍，去除细胞碎片，更换含10%胎牛血清的L-15培养基继续培养20 h，倒置显微镜下对划痕前后的相应区域拍照。设3复孔，重复3次。

1.2.2.5 体外癌细胞侵袭试验 根据文献[10]的方法，以Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力。400倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数，以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力。随机计数5个视野内的细胞数，取平均值进行统计处理，每组计数3份样本。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 siRNA敲除对鼻咽癌细胞TDGF-1基因的影响

采用TDGF-1 siRNA转染鼻咽癌CNE-2细胞后，分别采用荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平。结果显示，与Con-A组细胞比较，siRNA组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显降低，且呈时间和浓度依赖性(mRNA：均P<0.005；蛋白：均P<0.005)；而Con-B组与Con-A组细胞比较，TDGF-1 mRNA和蛋白水平并无明显差异(均P>0.05)。(见图1、2)。

图1 TDGF-1 siRNA转染对鼻咽癌CNE-2细胞TDGF-1mRNA水平的影响(注：Con-A与Con-B曲线重叠)

图2 TDGF-1 siRNA转染对鼻咽癌CNE-2细胞TDGF-1蛋白水平的影响

2.2 TDGF-1 siRNA转染对鼻咽癌细胞软琼脂集落形成的影响

软琼脂集落形成试验结果发现，鼻咽癌CNE-2细胞在体外半固体培养体系中可以自发地形成集落，而经TDGF-1 siRNA转染的细胞集落生长呈剂量依赖性减少(r=-0.891，P<0.005)。见图3。

2.3 TDGF-1 siRNA转染对鼻咽癌细胞迁移的影响

采用划痕试验评测TDGF-1 siRNA转染对癌细胞迁移能力的影响。结果显示，TDGF-1 siRNA转染组迁移距离明显低于对照组，且呈浓度依赖性(r=-0.836，P<0.005)。见图4。

2.4 TDGF-1 siRNA对鼻咽癌细胞侵袭的影响

Boyden小室上室细胞穿过膜上matrigel到膜的下室面，其数量反映了细胞侵袭能力的大小。收集TDGF-1 siRNA转染48 h的细胞，采用Boyden小室检测癌细胞侵袭情况。结果发现，与对照组比较，siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降，且呈浓度依赖性(r=-0.889，P<0.005)。见图5。

图3 TDGF-1 siRNA转染对鼻咽癌细胞锚着不依赖性增殖的影响

图5 TDGF-1 siRNA转染对鼻咽癌CNE-2细胞体外侵袭的影响

3 讨论

近年来，在基因研究领域中，RNAi和siRNA已得到较广泛应用。RNAi是一种调节mRNA的生物学现象，能够使基因的mRNA被相应的双链RNA分子敲除，其效果要远强于正义和反义RNA[11]。RNAi最主要的功能在于可以调节和关闭基因的表达，进而调控细胞的各种高级生命活动。而siRNA是指RNAi过程中在细胞内产生的长约21～25核苷酸(nt)的小双链RNA分子，是RNAi作用机制的重要中间效应分子，目前，已经有人工化学合成的siRNA，具有明显的敲除相应基因mRNA的效果[12]。

为了解TDGF-1基因在鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用，我们根据TDGF-1基因mRNA特点，设计了siRNA序列，并用化学方法合成，转染鼻咽癌CNE-2细胞后，分别采用荧光实时定量PCR和蛋白质印迹法方法检测TDGF-1 基因mRNA和蛋白水平。结果显示，转染组细胞TDGF-1基因mRNA和蛋白水平明显下降。接着，我们进一步在体外观察了TDGF-1 基因下调对鼻咽癌CNE-2细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

正常真核细胞，除成熟血细胞外，大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，即称为锚着依赖性(anchorage dependence)。癌细胞可以锚着不依赖性状态生长。癌细胞在软琼脂形成集落的多少与恶性程度呈正相关。癌细胞侵袭能力强，则在软琼脂上形成的集落数目多。软琼脂集落培养试验结果显示，经TDGF-1 siRNA转染处理的鼻咽癌CNE-2细胞软琼脂集落数明显减少，且呈浓度依赖性(P<0.005)。

癌细胞远处转移过程中，迁移和侵袭是重要步骤。本研究分别采用划痕试验和Boyden小室模型检测癌细胞迁移和侵袭能力。结果显示，转染组鼻咽癌细胞迁移和侵袭细胞数明显减少，且呈浓度依赖性。提示TDGF-1下调可抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力。

鼻咽癌细胞迁移、侵袭是一个复杂的过程，机制十分复杂，涉及到许多基因的变化。到目前为止，尚不清楚有哪些基因参与了TDGF-1基因调控鼻咽癌细胞侵袭转移的过程，有必要借助于基因芯片技术进一步探索其中的分子机制。

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