保留半肝动脉血供肝血流安全阻断时限的研究

穆振国，王新伟，王洪远，梁静雅，李建新，张 林，曹广涛

选择适当肝血流阻断方式是肝切除手术成功的基础，保留半肝动脉血供入肝血流阻断技术适用于半肝阻断困难的复杂肝切除患者。许多学者临床实践证实该技术在减少肝脏缺血再灌注损伤方面优于全肝血流阻断(Pringle法)[1]，但是该方法终究对肝脏有一定的损伤。Pringle法的安全时限为20 min[2]，那么保留半肝动脉血供入肝血流阻断技术的安全时限究竟是多少，目前尚不确切。本研究通过动物实验，以Pringle法20 min的动物肝脏损害程度及存活率为评判标准，探讨门静脉自然转流及非转流情况下保留半肝动脉血供肝血流阻断的安全时限，以期指导临床，尤其对肝硬化合并门静脉高压患者实施肝切除时肝门阻断的再认识有重要意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

实验动物为雄性Wistar大鼠，体重230～260 g，由济宁医学院动物实验中心提供。将大鼠随机分为 3组：A组为门静脉转流下保留半肝动脉血供入肝血流阻断组，B组为单纯保留半肝动脉血供入肝血流阻断组，C组为全肝入肝血流阻断组(Pringle法)。每组90只，其中40只观察存活率(每个时相点10只)，40只供病理学检查(每个时相点10只)。另取10只做染料示踪观察。各组阻断时相点分别以组别/时间(min)记录，如A/60代表A组，阻断60 min，以此类推。

1.2 动物模型的制备

1.2.1 术前准备 实验动物术前禁食12 h，自由饮水；麻醉方法为腹腔注射苯巴比妥钠15 mg，切口局部注射0.3%利多卡因0.1 mL。

1.2.2 A组 入腹后切断所有肝周韧带，分离出肝左、肝中动脉予以保护，随后结扎肝右叶肝蒂，用小号动脉夹分别阻断肝左、肝中叶门静脉60、90、100、120 min，缺血受累肝脏约占全肝 95%，保留尾状叶(约占全肝 5 %)血供，作为门静脉血液经肝脏回流入下腔静脉的通道。到预定观察终点，去除肝蒂阻断夹恢复肝脏灌流，切除肝右叶及尾状叶(肝切除量约32%)[3]，缝合腹壁切口。

1.2.3 B组 术前准备、麻醉及保留半肝动脉血供方法同A组。肝左、肝中叶门静脉阻断时间分别为30、40、60、90 min，不保留尾状叶血供，完全阻断门静脉血流。到预定观察点，去除肝蒂阻断夹恢复肝脏灌流，切除肝右叶及尾状叶，缝合腹壁切口。

1.2.4 C组 即Pringle法，术前准备及麻醉同A、B组。用小号动脉夹阻断肝十二指肠韧带，使包括尾状叶在内的全部肝叶完全缺血，阻断时间分别为20、30、40、50 min。到预定观察点，去除肝蒂阻断夹恢复肝脏灌流，切除肝右叶及尾状叶，缝合腹壁切口。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 观察阻断前后肝脏及胃肠的色质。

1.3.2 用亚甲蓝染色示踪法观察阻断血流后门静脉流出道的完整性及肝脏缺血的完全性。

1.3.3 肝功能检测 恢复灌注后24 h分别抽血检测ALT数值。

1.3.4 肝脏病理组织学检查 入肝血流阻断各时相点及恢复灌注后24 h分别取肝组织标本，给以固定、切片、HE染色，光学显微镜下组织学观察。

1.3.5 肝细胞死亡率测定 采用全自动图象分析系统，在400倍视野下，每张玻片(上述标本)随机选取10个无血管区视野，测定检测区的苏木素染色阳性(细胞核染色为主)面积的平均面积百分数，用以估计相对细胞死亡率。阳性区的平均面积百分数越低，表示细胞相对死亡率越高[4]。

1.3.6 恢复灌注后24 h取10 cm空肠以检查肠黏膜的损害情况。

1.3.7 动物存活率观察 观察再灌注后7 d的动物存活率。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 入肝血流阻断后肝脏及胃肠的色质

2.1.1 A组 肝左、肝中叶由鲜红色变为红褐色，肝右叶呈紫黑色，尾状叶颜色不变。恢复灌流后肝左、肝中叶呈紫褐相间的花斑状，4～5 min后变为紫色，充血，肝缘变钝、饱满。阻断期及恢复血流后的肠壁颜色红润，无水肿。

2.1.2 B组 肝左、肝中叶由鲜红色变为红褐色，肝右叶及尾状叶均变为紫黑色。恢复灌流后肝左、肝中叶呈紫褐相间的花斑状，4～5 min后变为紫褐色，B/60、B/90肝脏色质恢复缓慢。阻断期大鼠的肠壁颜色紫黑，水肿明显，恢复血流4～5 min后肠壁颜色渐渐转红润。

2.1.3 C组 入肝血流阻断后3～4 min全肝变为紫褐色，随着阻断时间的延长渐渐呈暗灰色。肠壁紫黑，全腹腔脏器水肿明显。恢复灌流后肝缘变钝、肝叶水肿，C/40、C/50肝脏色质恢复缓慢。

2.2 亚甲蓝染色示踪观察

经门静脉穿刺注射亚甲蓝后，A组可见肝尾叶首先染色，随后心、肺及胃肠道均有染色，而所阻断肝叶在复流前不染色。B、C组在经门静脉穿刺注射亚甲蓝后穿刺点渗血，亚甲蓝外溢，心、肺、肝均无染色。

2.3 肝脏病理组织学观察及HE染色(细胞核)阳性面积的平均百分数

2.3.1 光学显微镜下观察 复流前各组肝脏标本均可见局部肝窦淤血及轻度扩张，肝小叶结构完整，汇管区正常。复流后A/60、A/90、A/100、B/30、B/40及C/20大鼠肝脏标本可见肝窦明显充血，肝细胞肿胀，汇管区炎性细胞浸润和点片状坏死灶。A/120、B/60及C/30大鼠肝窦内有淤积的红细胞和血栓形成，并可见部分细胞空泡变性、胞核消失、胞体崩解。汇管区有炎性细胞浸润，肝小叶变形。还可见局灶性肝细胞坏死。B/90、C/40、C/50大鼠24 h内全部死亡，未能获得标本。

2.3.2 肝脏HE染色(细胞核)阳性面积的平均百分数 A/120、B/60、C/30与C/20对照P<0.05；A/100、B/40与C/20对照P>0.05(见表1)。

2.4 复流后24 h各组ALT数值

复流后24 h各组ALT数值与肝门阻断时间成正相关，阻断时间越长ALT数值越高,A/120、B/60、C/30与C/20相比，差异有统计学意义，P<0.05；各组之间因阻断形式不同差别较大，但差异无统计学意义(A/100、B/40与C/20相比P>0.05)，详见表1。

表1 各组术后肝功能损害、肝细胞坏死数及术后存活率分析

注： * 与C/20对照，P>0.05；# 与C/20对照，P<0.05

2.5 小肠组织病理形态学观察

A/60、A/90、A100、B/30、B/40、C/20未见明显的组织学改变；A/120、B/60、C/30可见小肠黏膜绒毛变矮、水肿，上皮下Gruenhagen’s间隙增大，伴随上皮层与固有层分离，伴随毛细血管淤血、间质水肿及少量炎性细胞浸润(以中性粒细胞和淋巴细胞为主)；B/60部分标本出现绒毛破损伴随固有层毛细血管暴露甚至出血，炎性细胞在固有层或内皮下大量聚集，肠上皮细胞坏死、脱落。

2.6 手术后7d大鼠存活率

A/60、A/90、A/100大鼠无死亡，A/120存活率则下降为40%；B/30、B/40大鼠无死亡，存活率B/60下降至30%，B/90下降为0；C/20大鼠无死亡，C/30存活率下降至70%，C/40、C/50下降为0。各组大鼠死亡时间多发生在术后1～2天。

3 讨论

肝脏是对缺血缺氧甚为敏感的器官,其耐受缺血缺氧的时限可以随着肝脏所处环境的变化而变化。复杂肝切除术需要较长时间的肝血流阻断，当传统半肝血流阻断困难的情况下，保留半肝动脉血供肝血流阻断技术很好地扮演了替代者角色，在减少肝脏缺血再灌注损伤方面优于全肝血流阻断(Pringle法)[5]。然而在临床实践中此项技术肝门阻断多长时间是安全的目前尚不明了，尤其是对肝硬化合并门静脉高压患者，当伴有大量门静脉侧枝循环时，其安全时限是延长还是缩短亦存在许多争议。

Nakao等[2]通过临床观察认为入肝血流阻断不宜超过 20 min；Tashiro等[6]认为门静脉阻断 45 min后,即使再通也会发生广泛肠黏膜坏死；赵建勇等[7]进行猪单纯门静脉血流阻断实验，发现阻断45 min以内的动物存活率为100%，阻断60 min组则减少到66.7%；丁钧等[8]发现利用生物泵行门体静脉转流可使家猪常温下耐受全肝血流阻断的安全时限从 30 min延长为 90 min。黄波等[9]研究发现肠腔分流条件下，正常巴马小型猪耐受单纯门静脉阻断安全时限为120 min。所以，不难看出，既往所用各种大小动物入肝血流阻断模型，与保留半肝动脉血供入肝血流阻断技术均有其不同之处。本实验设计了门静脉转流及非转流两种条件下保留半肝动脉血供入肝血流阻断形式。前者以复流后切除的非缺血肝尾叶作为其他肝叶阻断期间门静脉血的流出道，既提升了门静脉血的压力，又达到了门静脉血转流目的，符合肝硬化合并门静脉高压患者的临床病理机制；两组实验动物的肝右叶+肝尾叶切除占全肝总量的32%，其肝切除模型符合临床手术实际；恢复灌注后24 h取10 cm空肠检查肠黏膜损害情况可以协助分析肝脏缺血再灌注损伤以及实验动物死亡的肠源性因素；以Pringle法阻断肝门20 min的动物肝脏损害程度为评判标准得出的保留半肝动脉血供肝血流阻断安全时限(门静脉转流或无转流的情况下)有较高的临床指导意义。

从本项研究结果可以看出，肝脏的缺血再灌注损伤与肝血流阻断形式及阻断时间密切相关，C/20实验动物手术后7d全部存活，而C/30则存活70%，在术后24 h ALT数值、HE染色(细胞核)阳性面积的平均百分数方面，C/20与C/30相比也有显著差异(P<0.05)。所以，用C/20实验动物的肝脏损害程度及术后7 d存活率作为安全与否的评判标准是可行的。在A、B、C三组中，A组的阻断形式对肝脏的损害最轻，B组次之，C组最重。A/100、B/40与C/20损害程度相当，也就是说大鼠门静脉转流下保留半肝动脉血供入肝血流阻断的安全时限是100min，单纯保留半肝动脉血供入肝血流阻断组的安全时限是40 min。

[1]金山,戴朝六,贾昌俊,等.保留半肝动脉血供的入肝血流阻断法对大鼠肝缺血再灌注损伤的影响[J].世界华人消化杂志,2007,15(30): 3168-3172 .

[2]Nakao A,Harada A,Nonami T,et al.Regional vascular resection using catheter bypass procedure for pancreatic cancer[J].Hepatogastroenterology,1995,42(5):734-739.

[3]何效东,董家鸿,蔡景修,等.门静脉转流下入肝血流阻断动物模型的建立及评价[J].西北国防医学杂志,1999,20 (3):175-177.

[4]元文勇,余伟平,叶启发,等.大鼠肝脏缺血再灌注损伤程度判定指标的选择[J].中国普通外科杂志,2008,17 (7): 650-653.

[5]穆振国,王海水,穆童,等.保留半肝动脉血供联合肝缺血预处理在肝硬化复杂肝切除术中的应用[J].中国现代普通外科进展，2010,13 (7): 550-553.

[6]Tashiro S,Uchino R,Hiraoka T,et al.Surgical indication and significance of portal vein resection in biliary and pancreatic cancer[J].Surgery,1991,109 (4): 481-487.

[7]赵建勇,董家鸿,詹国清,等.猪单纯门静脉血流阻断安全时限的研究[J].第三军医大学学报,2001，23(8)：965-967.

[8]丁钧,董家鸿,杨占宇,等.家猪常温下耐受入肝血流阻断安全时限的研究[J].中华实验外科杂志,2004,21(3): 311-313.

[9]黄波,别平,冯春林,等.肠腔分流条件下猪单纯门静脉阻断的安全时限[J].第三军医大学学报,2008,30 (24): 2299-2301.