鸡IFN-γ与鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E抗原共表达DNA疫苗的免疫保护性研究

徐守振,潘保良

(1.青岛农业大学动物科技学院,山东青岛266109;2.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一类细胞内寄生虫病,每年给全球养禽业带来巨大的经济损失。疫苗接种克服了药物防治出现的耐药性和药残等缺点,逐渐成为防治鸡球虫病的研究热点。目前,球虫DNA疫苗预防球虫病已获得部分保护效果[1],许多学者试图从优化载体设计、采用有效接种途径、使用分子佐剂等进一步增强其免疫保护效果。鸡干扰素-γ(IFN-γ)能够抑制鸡艾美耳球虫的发育,因此IFN-γ常同DNA疫苗共同免疫来增强免疫保护作用[2]。本试验构建了融合有鸡IFN-γ和E.tenella 3-1E抗原基因的双价真核表达质粒,研究IFN-γ的免疫增强作用,为E.tenella DNA疫苗的进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1日龄AA肉鸡购自北京华都肉鸡有限公司。

1.2 虫株、菌株和质粒 E.tenella GS株、pGEX-I(含鸡IFN-γ基因)和p GEX-E(含 E.tenella GS株3-1E基因)为中国农业大学国家原虫实验室保存。真核表达载体proVAX、PK-15细胞为青岛农业大学预防兽医学实验室保存。

1.3 主要试剂 限制性内切酶Eco R I、Xho I、DNA连接试剂盒、DNA回收纯化试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司。DMEM细胞培养液,购自 GIBCO/BRL公司。EndoFree Plasmid Maxi Kit,购自Qiagen公司。脂质体转染试剂盒(LipofectamineTM),购自Invitrogen公司。兔抗重组蛋白IFN-γ/3-1E(rIE)抗体由本实验室制备并保存。FITC标记的羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 引物设计与合成 根据IFN-γ和3-1E序列及SOE-PCR引物设计原则,共设计 4条引物。P1：5′-CCGGAATTCCATACTGCAAGTAGTCTAATTC-3′(Eco R I),P7：5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC GCAATTGCATCT-CCTCTG-3′,P8：5′-GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG ATGGGTGAAG-AGGCTGATAC-3′,P4：5′-CCGCTCGAGTTAGAAGCCGCCCTGGTACAG-3′(Xho I)。连接IFN-γ和3-1E的(GGGGS)315氨基酸的 linker1 序列为：5′-GGTGGAGGC GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3′(引物斜体部分),所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 融合基因SOE-PCR扩增 以pGEX-I为模板,用P1和 P7扩增 IFN-γ-linker1片段,反应总体积50μL：ddH 2O 35μL,10×Buffer 5μL,d NTP 4μL,模板3μL,引物各1μL,Pyrobest DNA 聚合酶1μL;反应条件：94℃5 min,94℃ 1 min,58℃1min,72℃1min,72℃10 min,共30个循环。在相同反应条件和体积下,以pGEX-E为模板,用P8和P4扩增linker1-3-1E片段。纯化回收的IFN-γ-linker1和linker1-3-1E片段各1μL用作模板,用P1和P4扩增IFN-γ/3-1E融合基因,反应总体积 50 μL：dd H2O 36 μL,10×Buffer 5μL,dNTP 4 μL,模板2μL,引物各1μL,Pyrobest DNA聚合酶1μL;反应条件：94℃5 min,94℃1 min,50℃1 min,72℃1.5 min,5个循环;94℃1 min,58℃1 min,72℃1.5 min,72℃延伸10 min,24个循环。

1.6 真核质粒的构建与鉴定 IFN-γ/3-1E融合基因和p GEX-I、pGEX-E及proVAX分别用Eco RⅠ+XhoⅠ酶切,连接、转化、PCR及酶切鉴定均按常规方法操作。阳性克隆命名为prol、proE和prolE,同时测序。按转染试剂盒说明书将无内毒素质粒大提试剂盒制备的 proI、proE、proIE和proVAX体外转染PK-15细胞。转染后第30小时用间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的瞬时表达情况,一抗为兔抗rIE融合蛋白抗体(1∶100),二抗为羊抗兔FITC标记抗体(1∶200)。

1.7 免疫保护效果评估 1日龄AA肉鸡养至5日龄时随机分为非免疫非感染对照组、非免疫感染对照组、proVAX组、proI组、proE组和 proIE组,每组各 20只;7日龄首免50μg/只的 porVAX、proI、proE和proIE;14日龄加强免疫一次;21日龄称重,经口感染5×104个E.tenella GS株孢子化卵囊;30日龄鸡只称重、剖杀。选取粪便中卵囊排出量和鸡体增重作为免疫保护评价指标。平均增重=攻虫后第10天体重-攻虫时体重。收集感染后5～10 d的粪样,计算粪便中卵囊排出量。

1.8 数据处理 所有数据采用SPSS 12.0软件分析,比较各组间差异。

2 结果

2.1 融合基因的扩增 用P1和 P7扩增得到约450 bp的特异条带(IFN-γ-linker1),用 P8和P4扩增得到约500 bp的特异性条带(linker1-3-1E),以IFN-γ-linker1和 linker1-3-1E 为模板,用 P1和 P4扩增得到约1 000 bp的IFN-γ/3-1E融合基因特异条带(见图1)。

2.2 真核质粒的构建与鉴定 Eco RⅠ+XhoⅠ对proI、proE和proIE双酶切,分别释放出435 bp、516 bp和996 bp的特异片段及2 900 bp的载体片段。PCR及测序进一步验证成功构建了proI、proE和proIE重组质粒。将重组质粒分别转染PK-15细胞,IFA检测发现转染proI、proE和proIE的PK-15细胞浆出现特异的黄绿色荧光,而转染proVAX的无特异荧光,表明构建的重组质粒均可在PK-15细胞中成功表达所携带的目的基因。

图1 IFN-γ/3-1E融合基因的构建

2.3 免疫保护效果 各组攻虫后均无死亡,攻虫对照组体重显著下降,核酸疫苗组均可提高相对增重。proI组体重几乎恢复到非感染对照组,显著高于proE(P＜0.05)。proIE组相对增重略高于proI和proE组,但差异不显著(见图2)。proIE组与proE组和proI组相比卵囊排出量显著下降(P＜0.05),proI组与proE组卵囊排出差异不显著(P＞0.05)。proIE组卵囊排出量最低(5.6×108个),为攻虫对照组(16.2×108个)的 34.6%(见图3)。

图2 DNA疫苗免疫后各组的增重情况

3 讨论

艾美耳球虫3-1E抗原为鸡艾美球虫子孢子与裂殖子阶段的表面抗原,在E.tenella、E.acervulina和E.necatrix之间均有很高的同源性能够诱导交叉保护[3],是一个很好的可用于预防球虫病田间感染的潜在保护性抗原。本研究也表明含E.tenella 3-1E的proE能显著降低E.tenella攻虫感染后粪便中卵囊的排出量,抑制艾美耳球虫在体内繁殖。

Min等(2001)研究了细胞因子对堆型艾美耳球虫DNA疫苗(pcDNA3-1E)免疫的增强效果,发现同时注射 IFN-γ,体内球虫繁殖速度明显减慢[4]。周建民等研究(2005)也发现,同时免疫3-1E基因和鸡IFN-γ基因DNA疫苗与单纯的3-1E免疫能进一步减少卵囊排出量[5]。本试验应用SOE-PCR构建了含E.tenella 3-1E和鸡IFN-γ基因的proIE,proIE免疫后同proI和proE单纯免疫相比,同源攻虫后能进一步减少卵囊的排出和增加体重,获得更强的免疫保护。这表明鸡IFN-γ与3-1E抗原基因融合后具有协同作用,15个柔性氨基酸连接子确保3-1E和鸡IFN-γ蛋白都能在体内正确表达发挥各自功能,两基因融合表达时他们各自的抗原表位不被覆盖。本研究表明,鸡IFN-γ以融合形式作为E.tenella 3-1E DNA疫苗的基因佐剂能够增强其免疫保护效果,为进一步研究其在控制鸡球虫病上的应用奠定了基础。

[1] 吴绍强,蒋金书,刘群,等.鸡球虫疫苗研究进展[J].畜牧兽医学报,2005,36(1)：1-5.

[2] Lillehoj H S,Ding X.Resistance to intestinal coccidiosis following DNA immunization with the cloned 3-1E Eimer ia gene plus IL-2,IL-15,and IFN-gamma[J].Avian Dis,2005,49：112-117﹒

[3] Song K D,Lillehoj H S,Choi K D,etal.A DNA vaccine encoding a conserved Eimer ia p rotein induces protective immunity against live Eimer ia acervulina challenge[J].Vaccine,2000,19：243-252 ﹒

[4] Min W,Lillehoj H S,Burnside J,et al.Adjuvant effects of IL-1beta,IL-2,IL-8,IL-15,IFN-alpha,IFN-gamma TGF-beta and lymphotactin on DNA vaccination against Eimeria acervulina[J].Vaccine,2001,20：267-274 ﹒

[5] 周建民.鸡球虫核酸疫苗的研究[D].北京︰中国农业大学,2005﹒