抗金玉兰酶制剂(β-内酰胺酶)单克隆抗体的研制与特性分析

张小兵,吴 萌,邸禄芹,李君华,齐颖颖,闫静辉

(1.河北省科学院生物研究所,河北 石家庄 050081;2.河北医科大学第三医院,河北 石家庄 050051)

目前,青霉素作为β-内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物,是牛奶中最常见的残留抗生素。由于乳品企业对抗生素残留超标的牛乳拒收,于是,一些不法奶站为了谋求自己的经济利益,便使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素,生产所谓“无抗奶”。2009年2月,卫生部公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》中指出金玉兰酶制剂(β-内酰胺酶)为掩蔽乳及乳制品中抗生素的非法添加物。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性,导致细菌对青霉素、头孢菌素等抗生素类药物的耐药性增高。

为了准确、特异和快速地检测这种添加物,我们以金玉兰酶制剂为抗原,制备了相应的单克隆抗体,为利用免疫学方法检查牛奶中的金玉兰酶制剂奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂和仪器 BALB/c小鼠(河北实验动物中心),β-内酰胺酶(金玉兰酶制剂),HAT、H T、PEG、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂(Sigma公司),小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞(本研究室保存),DMEM培养基、细胞培养板(GIBCO),辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司),小鼠单克隆抗体亚型试剂盒(Sigma公司),辣根过氧化物酶(HRP,北京华美生科生物技术有限公司)。兔抗金玉兰酶制剂多抗(自制)。其他试剂均为分析纯。

96孔聚苯乙烯酶标板(厦门市云鹏科技发展有限公司)、酶联免疫检测仪(Tecan公司)、凝胶成像仪(UVP)。

1.2 杂交瘤细胞株的建立[1]用6只7～8周龄BALB/c小鼠,基础免疫用福氏完全佐剂与等体积β-内酰胺酶溶液(β-内酰胺酶100 μg/只小鼠)混合乳化后颈背部多点注射。两周后第2次免疫,用福氏不完全佐剂与首次相同剂量抗原乳化后颈背部多点注射。再两周后,测小鼠血清抗体效价。选取最佳免疫小鼠于融合前3 d腹腔注射抗原液100μg,作加强免疫。

取对数生长期的小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞,按常规方法进行融合。检测培养上清抗体效价,选择强阳性克隆,用有限稀释法连续亚克隆,直至100%阳性。将建立的稳定分泌高特异、高效价抗体的杂交瘤细胞株,置液氮中保存。

1.3 单克隆抗体的制备及特性分析 将各细胞株分别接种于预先致敏的成年BALB/c小鼠腹腔内,7～10 d后收集腹水。以间接 EL1SA法测定抗体效价。

单抗灵敏度测定也采用间接ELISA法;β-内酰胺酶起始浓度为5μg/mL,倍比稀释后包被酶标板;腹水抗体的工作浓度为1∶5 000～1∶10 000。以β-内酰胺酶阴性鲜牛奶包被酶标板,测定各抗体特异性。采用Sigma公司抗体亚型检测试剂盒检测抗体类型及亚类。用蛋白A纯化小鼠腹水[2-3],SDS-PAGE法检测抗体纯度[4],并用凝胶成像系统进行分析。采用紫外吸收法[5]对抗体浓度进行测定。单抗的亲和力常数用非竞争酶免疫法[6]测定。抗体标酶采用高碘酸钠法[7]。

ELISA相加试验[8]测定单克隆抗体抗原表位。以β-内酰胺酶包被酶标板,分别在不同的孔中加入McAb(1和2)和同时加入两株McAbs(1+2),然后加入酶标记的羊抗鼠Ig,以四甲基联苯胺为底物,终止反应后测得OD值A 1、A 2和A 1+2。

McAbs最佳配对的选择,按方阵交叉匹配法[9]进行。分别以各种McAbs包被酶标板,以β-内酰胺酶为中心抗原,和每种HRP标记的McAb逐一进行交叉匹配试验。

2 结果与讨论

2.1 鼠抗β-内酰胺酶杂交瘤细胞株的建立 共进行了两次细胞融合,每次用6块96孔板,平均每孔有1～2株融合细胞生长,融合率为100%。经过对阳性孔多次亚克隆,共获得16株稳定分泌抗β-内酰胺酶的杂交瘤细胞株。分别命名为：1B3、1B10、1C2、1H 3、2H5、3B6、3H8、3H 6、3G4、4H2、4H 8、4G11、4F11、4D11、5C10、5C8 。

2.2 抗体的制备及纯化 16株杂交瘤细胞株分别注射到成年BALB/c小鼠腹腔内诱发腹水,每只获取3～9 mL腹水。腹水效价为1∶10万～1∶1 310万。灵敏度测定结果表明,大多数抗体可检测β-内酰胺酶的最低浓度在39 ng/mL～150 ng/mL之间,而单抗4F11的最低检测浓度是19 ng/mL。分别取2～3 mL进行纯化,纯化后蛋白含量15.6 mg/mL～33.3 mg/mL,凝胶成像分析纯度达 87%～93%。

林业生态保护与天然林保护不仅会影响社会经济的发展，也会给人类的生活带来影响。所以，我们应该加强保护工作，使林业能够可持续发展。我国的经济建设也离不开林业的支持，只有不断提高森林覆盖率，才能有效推动我国经济发展。

2.3 抗体特性鉴定

2.3.1 抗体的特异性和亚型鉴定 在用阴性鲜牛奶包被酶标板的间接ELISA试验中,各单克隆抗体与之皆无交叉反应;用Sigma公司的抗体亚型试剂盒鉴定,结果 3H 6为 IgG2a,3G4和 4G11为IgG2b,其余皆为IgG1(见中插彩版图1)。

2.3.2 单克隆抗体识别抗原表位特性分析 为了测定单抗识别抗原表位的特性,先以棋盘法测定酶标记羊抗鼠Ig的饱和度,并测定抗原与McAbs的饱和浓度。在本试验系统中,酶标记羊抗鼠Ig为1∶3 000倍稀释,各株单抗腹水根据所测饱和浓度分别作1∶400～1∶1 000倍稀释。

所测OD.值利用如下公式计算相加指数(addictivity index,AI),结果以AI值的大小判定。公式：

若两株McAbs识别抗原的同一表位,A 1+2应等于A1和 A2的均值,AI应为零;若两株McAb识别不同的表位,A 1+2应等于A 1和A 2的总和,AI则等于100%。实际测定中,一般以AI值小于50%判定为识别相同的表位,以AI值大于50%判定为识别不同的表位。

结果表明,只有单克隆抗体5C10与3B6互交相加后,计算得出的 AI值大于 50%(AI值为76.1%),具有相加性,它们识别抗原上不同的表位且表位的距离较远;其余各单抗间,AI值均小于50%,则这些单抗所结合的表位是相同或距离较近,彼此间有空间位阻,没有互补或相加的特性。

2.3.3 最佳配对的选择 所获得单抗中有三株的效价达1∶1 310多万,它们是1B10、2H5和4F11。据相加试验的结果,初步判定这3株抗体结合的表位是相同或相似的。于是,先对4F11进行标酶。标酶后 ,用β-内酰胺酶、β-内酰胺酶阴性牛奶、小牛血清和单克隆抗体4F11分别包被酶标板,选择标酶后4F11(4F11-HRP)的初始浓度为2.5μg/mL,按2n(n=0,1,2…)倍比稀释,进行4F11-HRP的特异性测定(见中插彩版图2)。

进行单抗最佳配对选择试验时,用4F11和兔抗β-内酰胺酶多抗分别包被酶标板,并用与β-内酰胺酶反应阴性的血清包被酶标板做阴性对照,选择β-内酰胺酶的初始酶活为 1 500酶活单位/μL,按2n(n=0,1,2…)倍比稀释。发现4F11-HRP可分别与单抗4F11和兔多抗配对检测到β-内酰胺酶,结果见中插彩版图3。

抗原分子上的表位,是有线性的氨基酸残基或者非连续序列折叠形成的紧密的三维结构,它们在抗原的表面,是局部表面结构[10]。4F11-HRP能与4F11配对检测到β-内酰胺酶,表明该抗原分子表面有两个或两个以上相同或相似的表位;且其中,至少有2个这样的表位之间的距离较远,能同时结合2个4F11分子。于是,利用一支单抗就可以采用双抗夹心ELISA法完成对β-内酰胺酶的检测。这样就可以极大的缩短单抗的制备周期,降低成本,加快金玉兰酶制剂免疫学检测方法的建立。另外,由图3中还可以看出,4F11结合β-内酰胺酶的能力要远远强于兔多克隆抗体,即β-内酰胺酶浓度较高时,所测得OD值表现出明显差异。这是因为单抗是由单个杂交瘤克隆分泌的抗体组成,具有均质性,各抗体分子的亲和力完全一致;在抗原检测上具有高度一致的特性。多抗则不同,是含有不同亲和力抗体的复杂混合物。

试验结果表明,1B10、2H5和4F11均可实现单株抗体对β-内酰胺酶的检查;并各株单抗之间均能配对检测β-内酰胺酶。因此,可初步推断这3株单抗是抗同一表位的抗体。

2.3.4 亲和力测定 仅对以上3种效价最高的单抗进行了亲和力测定。结果显示,3株抗体的亲和力为1×107L/mol～1×1010L/mol,其中,4F11的亲和力是1×1010L/mol(见中插彩版图4)。

3 小结

本试验制备和选定的4F11、2H 5和1B10等几株单克隆抗体,效价高,抗β-内酰胺酶特异性好;并且利用一支单克隆抗体,通过双抗夹心ELISA法就可以实现对β-内酰胺酶的免疫学检测。这些抗体很适合用于研制有关检测牛奶中添加的β-内酰胺酶的试剂盒。

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