荣昌猪IFN-ω基因的克隆与序列分析

赵光伟,王 帆,赵春燕,杨晓伟

(1.西南大学荣昌校区动物医学系,重庆 荣昌402460;2.南京农业大学动物医学院,江苏南京210095)

干扰素(IFN)是机体天然免疫防御系统中的一类细胞因子,是一类具有广谱抗病毒、增强动物对各种疾病的免疫力等多种生物学功能的蛋白质。目前发现的猪干扰素包括 IFN-α、β、γ、δ、ω等[1],其中研究较热的有IFN-α,IFN-γ,对 IFN-ω的研究鲜有报道。IFN-ω是由5个以上的相关功能基因编码的[2],蛋白质家族中与IFN-α亚型之间同源性很高,天然的IFN-α常常是IFN-α与IFN-ω功能基因表达产物的混合体。目前临床中广泛使用的干扰素大多是利用基因工程技术表达出的单纯IFN-α的蛋白,这与天然的IFN-α存在一定的差异,这可能是导致实际临床使用时其效果相对较差的原因之一。荣昌猪是我国一个优良的地方品种,在川渝地区饲养存栏量很高。本试验旨在对荣昌猪IFN-ω进行克隆,获得目的基因,为进一步了解IFN-ω在荣昌猪抗感染、抗病毒免疫应答中的作用,提高荣昌猪的抗病能力以及丰富荣昌猪的基因资源做铺垫,发展荣昌猪养殖业。

1 材料与方法

1.1 试验动物 1月龄荣昌仔猪,购自重庆种猪场。

1.2 试剂 pMD18-T载体、T4连接酶、胶回收试剂盒、淋巴细胞分离液购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Catrimox-14TM RNA提取试剂盒、禽源反转录酶(AMV-RT)、Taq酶、dNTP、RNA 酶抑制剂等购自TaKaRa公司,宿主菌JM109由本实验室保存;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 荣昌猪外周血淋巴细胞(PBMC)的分离与培养 无菌采取健康荣昌猪血10 mL,分离淋巴细胞。将白细胞层移于另一试管,加等量RPMI 1 640液,2 000 r/min离心20 min,弃上清,沉淀物再加入等量RPMI 1 640液,同上离心3次,去上清;沉淀细胞用含10μg/mL ConA、100 mL/L小牛血清的RPMI 1 640培养液(含100μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素)悬浮,取10μL细胞悬液计数,将细胞悬液稀释至5×106/mL,置于细胞培养板中,5%CO2培养箱中37℃培养12 h。

1.4 荣昌猪总RNA的抽提 收集培养后的细胞,利用Catrimox-14 RNA提取试剂盒提取总RNA,操作方法严格按试剂盒使用说明书进行。提取的RNA保存于-80℃,备用。

1.5 引物设计 根据GenBank中已发表的野猪IFN-ω基因序列(EU797619),利用生物软件设计如下一对引物：上游引物：ATGGCCTTTGTGTTCTCTC;下游引物：TCAGGATGACCCCAGGTCTA,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.6 荣昌猪 IFN-ω基因的体外扩增 反转录条件：采用 20μL反应体系,其中模板 RNA 5μL,dNTP Mixture 1μL,5×RT-PCR Buffer 4 μL,MMulv Reverse Transcriptuse 1μL,Rnase inhibitor 0.5μL,特异下游引物 1μL,Rnase Free H 2O 7.5μL。反应条件30℃min,42℃40 min,95℃5 min。PCR条件：采用50μL反应体系,其中模板5 μL,上、下游特异引物各1 μL,LA Taq DNA Polymerase 0.5μL,d NTP Mixture 1 μL,dd H2O 16.5 μL。PCR反应条件为：94℃预变性4 min,94℃30 s,54.6℃30 s,72℃50 s,35个循环,72℃延伸10 min。后1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,并利用胶回收试剂盒回收特异的573 bp的DNA条带。

1.7 扩增片段的克隆与重组子的鉴定 将PCR产物连接到p MD18-T载体,转化大肠杆菌JM 109感受态细胞,通过蓝白斑筛选,选取蓝斑用小量提取法提取其质粒,进行PCR鉴定。

1.8 序列测定与分析 将初步鉴定的重组子质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序。序列测定结果利用DNAStar软件进行序列分析。

2 结果

2.1 荣昌猪IFN-ω基因的体外扩增结果 荣昌猪IFN-ω基因的RT-PCR结果如图1所示,经琼脂糖凝胶电泳,获得大小为573 bp的目的条带。

2.2 荣昌猪IFN-ω基因的测序结果(见图2) 荣昌猪IFN-ω基因测序结果如图 3所示,序列全长573 bp,含一个完整的开放阅读框(ORF),共编码191个氨基酸。

2.3 荣昌猪IFN-ω基因与其他动物IFN-ω基因同源性比较和进化树分析(见图3) 由图3可知,荣昌猪IFN-ω基因与野猪的的同源性最高,为99.5%,而与其他动物IFN-ω基因的同源性较低,其中与牛、野马、猫和人的同源性分别为66.0%,63.7%,47.6%,24.5%,由此可见,荣昌猪IFN-ω基因与野猪的进化关系最接近。

2.4 荣昌猪IFN-ω基因蛋白质二级结构的预测与抗原性分析见图4。

由图4可见,荣昌猪 IFN-ω基因具有 9个α螺旋,2个β折叠,10个转角和8个无规则卷曲,说明其二级结构比较复杂。对其抗原性分析预测发现其抗原性强的氨基酸位点较多,主要集中在35～75,95～130,150～190三个区域中,而其非抗原性的氨基酸位点少并且强度也比较弱,由此说明,荣昌猪IFN-ω基因翻译的蛋白具有良好的抗原性,极有可能增强荣昌猪的免疫力。对其进行疏水性分析发现,荣昌猪IFN-ω基因翻译的蛋白疏水性不强,具有12个亲水位点,其中有3个是强亲水位点。

图1 荣昌猪IFN-ω基因的RT-PCR

3 讨论

荣昌猪原产于重庆荣昌和隆昌两县,由于其适应性强、杂交配合力好、遗传性能稳定、瘦肉率较高、肉质优良、鬃白质好等优点,目前已经发展到全国除台湾外的各个省市,产区每年向外提供仔猪达140万头以上[3],是我国养猪业推广面积最大、最具有影响力的地方猪种之一。因此,对荣昌猪生物制品进行前期的研发是发展荣昌猪产业的必要保障。

本试验通过RT-PCR技术,从荣昌猪血液淋巴细胞中成功扩增出一特异条带,经序列测定,与GenBank上登载的野猪IFN-ω基因(EU797619)的同源性为99.5%,这证明已经成功克隆到荣昌猪IFN-ω基因。通过与其他物种的IFN-ω基因对比,表明与野猪的同源关系最为密切,与牛、野马、猫和人的关系分别次之。进而对其翻译蛋白的二级结构进行预测分析,发现IFN-ω蛋白具有较强的抗原性,主要集中在35～75,95～130,150～190三个区域中,这对于研究开发IFN-ω的生物制剂具有重要的指导意义。较强的抗原性通常具有较强的亲水性,虽然其原因还不甚明了,但该基因也符合这一规律,荣昌猪IFN-ω基因翻译的蛋白疏水性不强,具有12个亲水位点,其中有3个是强亲水位点。

干扰素是参与免疫调节的重要细胞因子,能够全面的促进体液免疫和细胞免疫,在抗病毒,抗肿瘤和增强免疫力方面发挥着重要的作用[4]。目前,临床生产中使用的干扰素多为利用基因工程表达的纯IFN-α的蛋白,由于IFN-ω是天然 IFN-α的功能基因表达产物之一,因此临床使用的干扰素与天然干扰素之间存在差异,这或许是临床使用干扰素时效果较天然干扰素较差的原因之一,本试验利用分子生物学技术将荣昌猪IFN-ω基因进行克隆,为开发研制其生物制剂奠定基础,以期能够提高干扰素的抗病效果。

[1] Lebon A,Toughd F.Links between innate and adap tive immunity via type I interferon[J].Current Opinion in Immunology,2002,14(4)：432-436.

[2] 李臣宾.IFN-ω的研究进展[J].国外医学：免疫学分册,2005,28(1)：7-9.

[3] 赵敏,张庭科,郝静,等.荣昌猪的品种特性与发展现状[J].中国牧业通讯,2009,22：32-34.

[4] Haller O,Kochs G,Weber F.Interferon,Mx,and viral countermeasures[J].Cy tokine and Growth Factor Reviews,2007,18(5)：425-433.