超高麦汁浓度酿造对啤酒酵母代谢的影响*

万春艳，赵海锋，赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

超高麦汁浓度酿造对啤酒酵母代谢的影响*

万春艳，赵海锋，赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

以11oP麦汁酿造作对比，研究了超高浓度酿造对酵母代谢的影响。结果表明，麦汁浓度升高降低了酵母利用葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的效率，其中对麦芽三糖和麦芽糖的影响较葡萄糖显著;随着麦汁中糖的消耗，发酵液中乙醇浓度的增加使酵母活性降低，乙醇比生成速率降低，从而导致整个发酵速度减缓，发酵周期显著延长;酵母通过在胞内大量积累海藻糖和甘油来应对高浓度麦汁所造成的高渗透压和高乙醇环境，麦汁浓度越高积累量越大。

超高浓度酿造，高浓度酿造，酵母代谢

高浓度酿造是采用较高浓度的麦汁(＞14oP)进行发酵，在生产过程的后期用饱和的CO2脱氧水稀释成正常浓度的啤酒的一种生产技术。利用18°P以上麦汁酿造称为超高浓酿造(Very High Gravity Brewing，VHGB)。与普通浓度酿造相比，VHGB可在不增加糖化和发酵设备的基础上大幅度提高啤酒产量，提高啤酒生产效率，具有明显的经济优势［1］。超高浓度麦汁中含有高浓度的可发酵性糖(麦芽糖、麦芽三糖和葡萄糖)，导致发酵初期发酵液的渗透压较高，发酵后期乙醇浓度较高及营养物质含量低等问题［2－3］。这些环境压力使得酵母生长代谢受到抑制，进而滞缓或停止发酵。

目前，VHGB对酵母发酵性能影响的研究，国外集中于分析酵母某些与发酵相关的基因的表达水平上。如Mizuno［4］等通过研究1株高产乙醇低产乙酸的突变菌株，发现其与糖酵解有关的许多基因的转录水平大大提高;Blieck［5］等证实了酵母发酵性能的提高与某些基因的改变有关。但这些分析并不系统而且彼此之间缺乏联系。国内则主要针对高渗透压、高乙醇含量等某一方面对酵母性能的影响进行阐述。如董永胜［6］等以气体为加压介质，研究了不同压力下酵母细胞生长特性及压力对酵母发酵性能的影响。但在VHGB中，针对酵母细胞的代谢情况还缺乏系统的分析，而这些正是从根本上改善和提高酵母发酵性能的基础。因此，本文系统研究了在VHGB中，啤酒酵母对可发酵性糖的利用、产乙醇情况以及胞内物质甘油和海藻糖含量的变化情况，以期从代谢和酵母的响应角度深入了解高浓酿造对酵母生理活性的影响，为啤酒高浓酿造优良菌种的选育提供理论基础。基于这些理论指导，耐超高浓酿造的酵母菌株正在选育当中。

1 材料与方法

1.1 菌种

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FB95，华南理工大学食品生物技术研究室保藏。

1.2 麦汁制备和发酵条件

麦汁制备:1 kg麦芽粉碎，以1∶4(g∶mL)的料水比进行糖化，45℃恒温30 min，升温至63℃恒温1 h，70℃恒温10 min，碘试，78℃恒温10 min后过滤，洗糟，105℃煮沸1.5 h。麦汁定型18oP，然后用60oP麦葡糖浆将麦汁浓度调至24oP(超高浓度麦汁)，将超高浓度麦汁分别稀释成18oP麦汁(高浓度麦汁)和12oP麦汁(正常浓度麦汁)，121℃灭菌15 min。

发酵条件:种子扩培见参考文献［7］;VHGB接种量为8 g(酵母泥)/L、高浓酿造接种量为6 g(酵母泥)/L、正常浓度酿造接种量为4 g(酵母泥)/L，12℃厌氧发酵。

1.3 主要设备和试剂

全自动糖化仪，杭州博日科技有限公司;低温培养箱，上海一恒科技有限公司;7LEBC发酵管，北京德之杰啤酒科技有限公司;Waters 600高效液相色谱仪。

葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖为色谱纯(Sigma公司);其他药品为分析纯;高浓麦葡糖浆(广州珠江啤酒有限公司)。

1.4 分析方法

麦汁表观浓度、表观发酵度、菌体干重(DCW)、菌体活性的分析见参考文献［8］;麦汁中糖分析:高效液相色谱法(HPLC)，色谱柱(Waters Spherisorb 5 μm NH24.6 ×250mm)，方法见参考文献［9］; 胞内海藻糖和甘油的提取与分析见参考文献［10］。

2 结果与讨论

2.1 麦汁浓度对酵母糖利用的影响

啤酒酵母FB95是1株用于正常浓度酿造(Normal Gravity Brewing，NGB)的啤酒酵母，在低于12oP麦汁中可正常发酵，当表观发酵度达到80%时，主发酵周期为7d(见图1)。随着麦汁浓度的升高，啤酒酵母FB95主发酵周期明显延长，高浓酿造(High Gravity Brewing，HGB)时为15d，VHGB 的时为28 d。

图1 不同浓度麦汁的降糖曲线

这是由于麦汁浓度越高，麦汁、发酵液的渗透压和乙醇产量也相应升高，渗透压升高使酵母形成生理干燥，乙醇浓度过高也对酵母产生毒害作用［11］，因此酵母生理活性降低，降糖速率也随之降低，主发酵周期延长。

麦汁成分复杂，其中主要的可发酵性糖包括葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖［12］，酵母对这3种糖利用的快慢直接影响其发酵速率。为研究VHGB和HGB中发酵周期延长的深层原因，本文检测了麦汁和发酵液中3种糖的含量，并对酵母降糖曲线进行拟合计算得到了酵母对3种糖的比吸收速率。由表1可知，在HGB和VHGB中，酵母对3种糖的最大比吸收速率和平均比吸收速率与NGB相比均有下降，VHGB下降的最大，HGB次之。在HGB中，比较最大和平均比吸收速率相对NGB的下降率发现，麦芽三糖的下降率最大(37.90%和 47.43%)，麦芽糖次之(20.34%和 44.36%)，葡萄糖最小(18.16%和46.76%)。在VHGB中，麦汁浓度进一步升高，对酵母代谢影响更加显著，麦汁三糖的最大和平均比吸收速率下降率分别为67.75%和68.15%，麦芽糖的分别为36.51%和62.83%，葡萄糖的分别为29.54%和57.52%。上述结果表明葡萄糖与麦芽糖和麦芽三糖不同的转运机制，酵母对麦芽糖和麦芽三糖的吸收需要能量(ATP转化成ADP)，而葡萄糖的吸收则不需要能量［12］。因此在高浓麦汁中，酵母活性降低，对麦芽糖和麦芽三糖的利用效率显著降低，是造成发酵后期降糖速率降低的重要原因。

表1 不同麦汁浓度对酵母利用麦汁糖的影响

2.2 麦汁浓度对酵母产乙醇的影响

由图2(A)知，麦汁浓度越高，发酵结束时乙醇浓度也越高，VHGB、HGB和NGB的乙醇体积分数分别为11.1%、7.99%和5.14%。高浓度的乙醇使酵母细胞膜的透性和构造发生变化，引起细胞膜对H+的通透性增加，使H+大量进入细胞，降低了细胞内外的离子浓度梯度，并使细胞质的pH值下降，从而导致细胞的生理状态发生变化，活性降低。酵母活性降低导致乙醇生成能力降低，结果见图2(B)，在NGB、HGB和VHGB中，乙醇的比生成速率变化趋势相同，在发酵初期比生成速率迅速下降，并随发酵的进行进一步降低，到发酵后期基本保持不变。

2.3 酵母对高浓度麦汁的响应

啤酒酿造过程是个复杂的生化反应过程，在此过程中，酵母的发酵环境不断变化。酵母细胞通过调控胞内的代谢情况能快速适应这些环境的变化。酵母胞内的海藻糖和甘油被认为是酵母细胞应对环境变化(乙醇浓度和渗透压升高)最重要的2种物质［13］。

图2 不同浓度麦汁发酵过程中酵母的乙醇浓度(A)和比生成速率(B)变化

海藻糖不仅是酵母胞内一种重要的贮藏性碳源，并且具有稳定细胞膜，使细胞具有更强的抵御外界不良环境维持正常生理功能的作用［14－16］。由图3可知，发酵初始，酵母胞内海藻糖迅速积累，且麦汁浓度越高，积累量越大，在NGB、HGB和VHGB中，酵母胞内海藻糖的最高含量分别为6.81%、9.59%和10.88%。这是酵母对高乙醇浓度所作出的响应。随着糖类物质的消耗，海藻糖的含量又迅速下降，原因一方面可能是海藻糖作为碳源物质被消耗，另一方面则可能是过高的渗透压和乙醇的毒性导致细胞膜的通透性改变，影响了海藻糖的合成与积累。

图3 不同浓度麦汁发酵过程中酵母胞内海藻糖含量变化

由图4可知，麦汁浓度越高，所产的胞内甘油也越多，在NGB、HGB和VHGB中酵母胞内的甘油最高含量分别为8.85%、11.00%和13.08%。随着发酵的进行胞内甘油迅速被消耗。甘油是酵母胞内最主要的相容性物质，能在胞内以高浓度存在而不对胞内的酶产生抑制或失活作用，当细胞处于高渗透压环境中时，细胞便通过提高胞内甘油的积累来抵御胞内水分外流，维持胞内外渗透压的平衡［14－16］。

图4 不同浓度麦汁发酵过程中酵母胞内甘油含量变化

综合胞内海藻糖和甘油的情况，发现在HGB中，酵母最直接的自我保护机制是通过海藻糖和甘油在胞内的大量积累来应对高浓麦汁所造成的高渗透压环境，积累量与麦汁浓度成正相关。随着发酵的进行，二者浓度迅速降低的原因又有所不同，海藻糖可能作为一种储藏性碳源被消耗，甘油则可能被运输到胞外，从而使得胞内的浓度逐渐降低。

3 结论

(1)麦汁浓度升高使主发酵周期延长，NGB、HGB和VHGB的主发酵周期分别为7、15和28 d。

(2)麦汁浓度升高影响了酵母利用葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的效率，对麦芽三糖和麦芽糖利用效率的影响比葡萄糖大，是主发酵后期降糖速率降低的重要原因。

(3)麦汁浓度升高，发酵液中乙醇浓度增加，使酵母活性降低，乙醇比生成速率降低。

(4)在HGB和VHGB中，酵母胞内的海藻糖和甘油含量比NGB高，反映了酵母对高浓度麦汁的自身调控作用。

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Effects of Very High Gravity Brewing on the Metabolism of Saccharomyces cerevisiae

Wan Chun-yan，Zhao Hai-feng，Zhao Mou-ming
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Effects of super high gravity brewing on the metabolism of Saccharomyces cerevisiae were examined in the present study.The results showed that higher gravity of wort caused significant decreased in utilization efficiency of Saccharomyces cerevisiae for glucose，maltose and maltotriose，particularly for maltose and maltotriose.Ethanol concentration in fermentation broth increased with the consumption of sugar which then decreased the yeast activity and the production rates of ethanol，and consequently slowed down the fermentation process and prolonged the fermentation time.Yeast responded to high osmotic pressure and high－alcohol environment caused by high gravity wort by accumulating trehalose and glycerol in the intracellular.The accumulation of trehalose and glycerol in the intracellular depends on the gravity of wort.

very high gravity brewing，high gravity brewing，metabolism of yeast

硕士研究生(赵海锋博士为通讯作者)。

*国家“十一五”科技支撑计划项目(2008BAI63B06)广东省科技计划工业项目(2009A010700004，2010A010500002)

2010－05－17，改回日期:2010－09－28