非水介质中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯*

王勍，郑璞，倪晔，孙志浩

(江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

非水介质中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯*

王勍，郑璞，倪晔，孙志浩

(江南大学生物工程学院，工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

研究了以蔗糖为起始原料，在非水介质中脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯。通过对反应介质、脂肪酶和酰基供体的筛选、转酯反应条件的优化得出，在DMSO/叔丁醇体系中，固定化脂肪酶Lipozyme TLIM能较好地催化乙酸乙烯酯和蔗糖进行转酯反应;反应的较佳条件为:DMSO/叔丁醇体积比1∶4，蔗糖与乙酸乙烯酯的摩尔比1∶10，蔗糖浓度0.06 mmoL/mL，固定化脂肪酶浓度80mg/mL，反应温度30℃，时间9 h，生成蔗糖-6-乙酸酯的产率为89.3%。并对产物进行了红外光谱及核磁共振分析，确证合成产物为蔗糖-6-乙酸酯。

蔗糖-6-乙酸酯，非水介质，脂肪酶，酰基供体，转酯反应

蔗糖-6-乙酸酯是单保护法合成超级甜味剂三氯蔗糖的关键中间体。三氯蔗糖是以蔗糖为原料经氯代而制得的一种非营养型强力甜味剂，甜度为蔗糖的600～700倍，且甜味纯正，甜味特性曲线几乎与蔗糖重叠。三氯蔗糖在人体内几乎不被吸收，热量值为零，可供肥胖、心血管病和糖尿病患者食用［1］。

合成蔗糖-6-乙酸酯的方法主要是传统的化学法，如乙酸酐酯化法［2］、有机金属合成法［3］、原酸酯法［4］等;也有关于酶法合成的报道［5－6］。蔗糖酯的化学合成反应条件一般比较苛刻，合成的产品颜色比较深，而且由于其选择性差，容易产生副产物［7］;酶法合成主要是利用酶对催化区域的高效选择性，使反应在需要的位置进行。1984年Rathbone等［5］申请了生物法合成蔗糖-6-乙酸酯的专利，先用枯草杆菌发酵葡萄糖生成葡萄糖-6-乙酸酯，再用果糖转移酶催化葡萄糖-6-乙酸酯和蔗糖生成蔗糖-6-乙酸酯，第1步发酵及第2步转化的最高得率分别为56%和58%。1992年Jonathan等［6］使用脂肪酶P Amano在吡啶溶液中催化蔗糖和乙酸异丙烯酯进行转酯反应，反应4 d得到蔗糖-6-乙酸酯的产率为33%。脂肪酶法合成蔗糖-6-乙酸酯具有反应条件较温和，催化选择性较强，产品安全性好等优点，但同时也存在反应时间长，产率偏低的缺点。为提高脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的效率，本文对脂肪酶催化蔗糖与酰基供体生成蔗糖-6-乙酸酯的转酯反应进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

蔗糖-6-乙酸酯标样(纯度80%)，加拿大TRC公司;枯草芽孢杆菌酶(游离态粉末)，山东杰诺生物酶有限公司惠赠;脂肪酶L 1754(游离态粉末)，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;固定化脂肪酶Lipozyme RMIM、Novozym 435、Lipozyme TLIM，北京高瑞森科技有限公司;TLC用薄层硅胶板，青岛海洋化学试剂公司;其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

高效液相色谱仪安捷伦1100系列，色谱柱Diamonsil C185 μm(250 ×4.6)mm;红外光谱仪 FTLA 2000-104，加拿大ABB Bomem公司;核磁共振波谱仪AVANCE III400 MHz，布鲁克·道尔顿公司。

1.2 方法

1.2.1 反应物料的预处理

将4 A分子筛于烘箱中105℃活化24 h以上，置于干燥器中冷却保存;将蔗糖于真空干燥箱中60℃下干燥24 h，置于干燥器中保存;液态反应物及所有的溶剂预先用活化好的4 A分子筛进行24 h以上除水。

1.2.2 酶促反应

在25mL的具塞单口反应烧瓶中加入0.3 mmol蔗糖，用5mL混合有机溶剂V(DMSO)∶V(叔丁醇)=1∶4完全溶解，预热至30℃后加入80 mg固定化脂肪酶TLIM，在相应温度下200 r/min振荡10 min，然后加入3 mmoL乙酸乙烯酯，置于振荡培养箱中继续振荡24 h。反应过程中间隔取样TLC检测分析，反应结束用HPLC检测鉴定并计算产率。除试验所考察因素外，其他反应条件均按该描述进行。

1.2.3 蔗糖-6-乙酸酯的分离纯化

反应结束后，离心除去脂肪酶;将得到的上清液于60℃真空蒸发，除去低沸点液体，搅拌母液同时加入过量的二氯甲烷，沉淀其中的蔗糖-6-乙酸酯，过滤得到淡黄色蔗糖-6-乙酸酯粗品。参照文献［8］的方法对粗品进行纯化。

1.3 分析方法

1.3.1 TLC 法定性分析

定性分析参照文献［9］。

1.3.2 HPLC 法定量分析

定量分析参照文献［10］。

1.4 蔗糖-6-乙酸酯产率计算

2 结果与讨论

2.1 脂肪酶催化合成蔗糖-6-乙酸酯的反应介质

基于蔗糖的溶解性和脂肪酶活性不受限制两方面因素选择反应介质。表1中比较了蔗糖在几种介质中的溶解性，以及分别以固定化脂肪酶Lipozyme TLIM和Novozym 435为催化剂，与乙酸乙烯酯合成蔗糖-6-乙酸酯的情况(TLC分析)。表1表明，在DMF、DMSO、吡啶、叔戊醇、叔丁醇中几乎不能合成蔗糖-6-乙酸酯。原因可能是:DMF、DMSO是极性较强的溶剂，具有较强的亲水性，会剥夺酶的“必需水”，从而导致酶的失活;蔗糖在叔戊醇、叔丁醇中的溶解度太低也导致反应无法进行，吡啶不适合该转酯反应。

表1 不同溶剂对合成蔗糖-6-乙酸酯的影响

在DMSO/叔丁醇体系中，少量的DMSO能促进蔗糖溶解，使转酯反应可以进行，由于反应介质大部分是叔丁醇，酶能够较稳定的存在，很大程度上降低了酶的失活［11］;虽然在DMSO/叔戊醇体系中，脂肪酶的催化效果与DMSO/叔丁醇体系相同，但考虑到DMSO/叔丁醇体系溶解性更好，有利于提高蔗糖产物浓度，因此选用DMSO/叔丁醇作为反应体系。如图1，当混合介质中DMSO与叔丁醇的体积比为1∶4时，蔗糖-6-乙酸酯产率较高。因此选用该比例混合溶剂作为转酯反应的溶剂体系。

图1 DMSO与叔丁醇比例对产率影响

2.2 脂肪酶对合成蔗糖-6-乙酸酯反应的影响

不同的酶对蔗糖分子中不同位置上羟基的选择性不同，从而得到不同的异构体。实验中比较了几种脂肪酶催化蔗糖和乙酸乙烯酯进行转酯反应，TLC法分析结果如表2

表2 不同脂肪酶的影响

根据HPLC检测结果得知，用Lipozyme TLIM做催化剂时，产率为80.1%。用Novozym 435做催化剂时产率只有37% 左右，同时还产生了差不多等量的异构体，而其他脂肪酶几乎不能催化反应。

进一步对酶的用量进行考察，比较不同浓度Lipozyme TLIM催化合成蔗糖-6-乙酸酯的产率。如图2，当 Lipozyme TLIM的浓度为 80mg/mL，产率为80.1%。随着酶量增加到一定程度，产率反而开始下降，其原因可能是过量的酶吸附了一定量的溶剂，导致底物过饱和而部分析出，无法参加反应而影响了产率。

2.3 乙酸乙烯酯对合成蔗糖-6-乙酸酯反应的影响

脂肪酶催化酰化的反应，是通过形成酰基-酶这个中间体发生的，因此酰基供体对反应有着显著的影响。通过比较乙酸乙烯酯、乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯和乙酸酐等酰基供体的转酯反应，TLC法分析检测发现乙酸乙烯酯是比较有效的酰基供体，而其他酰基供体几乎不能用于此转酯反应。这是因为，酶催化的转酯反应是一个亲核取代反应，酰基供体中的α碳原子的正电荷性越强，越容易被酶攻击;而生成的离去基团越易去除，则反应平衡方向越容易向合成新酯的方向移动。乙酸乙烯酯作为酰基供体时，生成的乙烯醇快速的转变为乙醛挥发掉，使得平衡方向向转酯反应移动。

图2 Lipozyme TLIM浓度对产率影响

图3 乙酸乙烯酯摩尔浓度对产率影响

根据图3可知，当酰基供体乙酸乙烯酯的用量达到0.6 mmol/mL，即蔗糖摩尔浓度的10倍时，产率为81.4%，再提高乙酸乙烯酯浓度已经对产率没有明显影响。

2.4 含水量对合成蔗糖-6-乙酸酯反应的影响

非水相酶促酯化反应中，体系中的含水量会影响反应的速率和反应的平衡位置。含水量过多会抑制平衡向产物方向的移动。因此，使用分子筛对各试剂进行预处理，以达到减少水分影响的目的。含水量对转酯反应的影响见图4，当体系中含水量为0.2mg/mL时，转酯效果明显低于无水状态下的效果;在反应前对试剂进行充分除水并在密闭条件下反应时，产率与在反应中加入分子筛时的产率基本相同。可见，反应前充分除水对转酯反应很有必要。

图4 含水量对产率影响

2.5 温度对合成蔗糖-6-乙酸酯反应的影响

温度对酶活有很大的影响，选择合适的温度能够使脂肪酶更好地催化反应进行。考察不同温度对反应的影响，结果如图5所示。30℃时，产物产率达到83.1%。超过40℃，酶活性明显下降，产率也随之降低。考虑到脂肪酶的回收与再利用，反应温度以30℃为宜。

图5 温度对产率的影响

2.6 蔗糖浓度对合成蔗糖-6-乙酸酯反应的影响

对于产品的生产来说，除了产率之外，产量也是一个很重要的指标。反应中增加底物的浓度可以使产量提高。蔗糖浓度在0.06～0.18 mmoL/mL时合成蔗糖-6-乙酸酯的产率情况见图6。

从图6可知，蔗糖浓度低于0.09 mmoL/mL时，蔗糖-6-乙酸酯产率为83%左右。如果蔗糖浓度过高，在振荡反应的过程中会有底物析出，使得产率降低。

2.7 蔗糖-6-乙酸酯的反应进程与脂肪酶的重复使用

图6 不同蔗糖浓度对产率的影响

从图7可看出，从反应开始到6 h这段时间里，蔗糖-6-乙酸酯随着时间的延长而急剧增加，然后变成缓慢增长。反应至9 h，产率达到最高值89.3%。随着时间的继续，副产物(主要是蔗糖二酯)逐渐产生，产率反而有所下降。

图7 蔗糖-6-乙酸酯的反应进程

将反应至9 h的固定化脂肪酶Lipozyme TLIM过滤取出，重新投入新的反应，观察重复使用后的产率。如图8，Lipozyme TLIM反复使用6次后，产率下降至初始产率的50%左右。酶活下降的主要因素可能是反应介质中的DMSO以及反应生成的乙醛对脂肪酶造成了伤害，从而降低了脂肪酶的催化效能。

图8 Lipozyme TLIM重复使用的产率

2.8 蔗糖-6-乙酸酯结构鉴定

蔗糖-6-乙酸酯粗品经过纯化后，得到蔗糖-6-乙酸酯晶体，对其进行红外光谱和核磁共振分析。

红外光谱分析(盐片涂膜法，溶剂为丙酮):如图9所示，3 417.6cm－1处的强宽吸收峰为羟基 O—H的伸缩振动的特征吸收，2 931.6cm－1处的弱吸收峰为烷烃饱和 C—H伸缩振动的特征吸收，1 735.8cm－1处的吸收峰为C=O的伸缩振动吸收峰，1 253.6cm－1处有酯基中C—O伸缩振动吸收峰，1 006～1 103cm－1处为—CH2OH中C—O伸缩振动的特征吸收峰，其中1 056.9cm－1处的强吸收峰为糖环特征吸收。另外929.6cm－1处的吸收峰，是 α-糖苷键的特征吸收。综合红外图谱分析，符合蔗糖-6-乙酸酯的结构特征。

图9 蔗糖-6-乙酸酯红外光谱分析

蔗糖-6-乙酸酯的核磁共振13C分析结果:13CNMR(C2D6SO，400MHz):170.41(—COCH2)，103.86(C2')，91.40(C1)，82.73(C5')，76.96(C3')，74.53(C4')，72.70(C3)，71.52(C2)，70.22(C5)，69.96(C4)，63.79(C')，62.60(C6')，62.27(C1')，20.63(—COCH2)。13C图谱结果与文献［12］提供的理论值相一致，从而可以认定该产品就是目标产物蔗糖-6-乙酸酯。

3 结论

固定化脂肪酶Lipozyme TLIM催化合成蔗糖-6-乙酸酯的较佳反应条件为:在30℃、200 r/min下，0.06 mmol/mL蔗糖溶液中加入80mg/mL的固定化脂肪酶Lipozyme TLIM和0.6 mmol/mL乙酸乙烯酯，反应9 h，蔗糖-6-乙酸酯的产率达到89.3%。产物经过TLC、HPLC、FTIR和NMR等分析鉴定，确认为蔗糖-6-乙酸酯。脂肪酶重复使用6次后，反应产率下降到初始产率50%左右，说明需要对脂肪酶进行再修饰，以达到多次利用，降低成本的目的。

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Lipase-catalyzed Synthesis of Sucrose-6-acetate in Nonaqueous Medium

Wang Qing，Zheng Pu，Ni Ye，Sun Zhi-hao
(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education;School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Synthesis of sucrose-6-acetate in non-aqueous medium from sucrose using lipase was studied.The transesterification conditions including reaction medium，acyl donor，enzyme，water content and temperature were investigated.Results showed that immobilized-lipase Lipozyme TLIM could effectively catalyzed sucrose and vinyl acetate to produce sucrose-6-acetate in the medium composing of DMSO and tert-butyl alcohol.A mole yield of 89.3%was reached when the transesterification was performed as follows:volume ratio of DMSO to tert-butyl alcohol 1∶4，mole ratio of vinyl acetate to sucrose 10∶1，concentration of sucrose 0.06 mmoL/mL，concentration of，enzyme 80mg/mL，reaction temperature of 30℃ and reaction time of 9 h.The structure of the products was also characterized as sucrose-6-acetate by FTIR and NMR.

sucrose-6-acetate，nonaqueous medium，lipase，acyl donor，esterification reaction

硕士研究生(郑璞教授为通讯作者)。

*国家重点基础研究发展计划“973”(No.2003CB716008)，国家自然科学基金(No.20473049)项目。

2010－07－13，改回日期:2010－10－08