无锡他汀分离式分段发酵初步研究

牟琳，诸葛斌，方慧英，诸葛健

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室和工业微生物研究中心，江苏无锡，214122)

无锡他汀分离式分段发酵初步研究

牟琳，诸葛斌，方慧英，诸葛健

(江南大学工业生物技术教育部重点实验室和工业微生物研究中心，江苏无锡，214122)

无锡他汀是一种新型HMG-CoA还原酶抑制剂，由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)转化产生的产物之一。转化产物Ⅰ则作为洛伐他汀转化为无锡他汀的中间产物，是影响无锡他汀生成及其产量的关键因素。研究发现，发酵过程中2种产物形成时的pH值有所不同。为提高无锡他汀产率，研究以pH值为主要调节因素，对发酵过程pH值调节、菌体补加和pH值协同调节，以及分离式分段发酵工艺进行了较全面的考察。结果表明，分离式分段发酵模式最好，即将产物Ⅰ分离提纯后作为底物再次发酵生成无锡他汀，2个阶段的pH值分别为7.5和5.5。同时也考察了金属离子对发酵的影响，研究表明，Fe2+、Mg2+和Cu2+对2种产物的生成均有一定促进作用。经策略优化，无锡他汀转化率提高15%，缩短了发酵时间，并使最终产物更易纯化。这种利用同菌株分离式分段发酵模式广泛为生成过程中存在中间产物或发酵时间较长的发酵过程的研究提供参考。

无锡他汀，同一菌株分离式分段发酵，pH值控制策略

他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂，为降脂药物中的首选药物，也是国内外研究的热点［1］。无锡他汀是由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)ST 2710 转化产生［2］。通过体外检测洛伐他汀及其转化产物对HMG-CoA还原酶活性的抑制作用，发现洛伐他汀对酶的IC50(他汀类物质抑制HMG-CoA还原酶活力50%时所用他汀类物质的量)为805.72μg/mL，而无锡他汀的IC50为202.17μg/mL，抑制作用为洛伐他汀的4倍，是一种新型高效羟甲基戊二酰酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂［3］，具有广阔的应用价值。

前期研究表明，洛伐他汀通过生物转化而来的转化产物Ⅰ和无锡他汀在发酵产量上存在着偶联关系，并初步确定该生物转化过程分为2个阶段［4］。此类产物的生物转化若采用常规发酵工艺对于产物的生成与产率可能产生负面影响，其主要原因可能是转化途径上相关酶的酶促最适条件存在差异，如pH、离子及反应体系成分等，而且，在某种环境下，以不同底物进行代谢和转化时，细胞需要做生理上的调整，这不仅会影响转化效率，而且由于细胞的调整导致发酵过程时间延长。本研究根据无锡他汀的转化特点，通过对发酵过程pH调节、菌体补加和pH协同调节，以及分离式分段发酵工艺进行了较全面的考察，尝试了一种同菌株的分离式分段发酵工艺，获得了良好的转化效果，这不仅为提高无锡他汀的生产与进一步研究打下了基础，而且该工艺可以为某些转化过程中存在中间产物累积且转化效率低、发酵时间较长的发酵产品提供一种解决途径。

1 材料与方法

1.1 菌株

拟无枝酸菌ST2710(Amycolatopsis sp.ST2710)，从自然界分离，本中心保藏。

1.2 培养基

A.高氏合成1号液体培养基(g/L):KNO31，无水K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，可溶性淀粉20，去离子水 1 000mL，pH 7.2～7.4

B.转化培养基(g/L):可溶性淀粉50，Hycase SF 2，玉米浆5，去离子水1 000mL

1.3 产物Ⅰ的制备

转化培养基加底物后20h，产物Ⅰ大量生成而无锡他汀还未形成时离心浓缩，以大孔吸附树脂为柱填料，甲醇为洗脱剂进行阶段式洗脱，并收集富集产物Ⅰ的洗脱液，浓缩后微孔膜过滤除菌备用。

1.4 培养方法

种子培养:将斜面Amycolatopsis sp.ST 2710接种到种子培养基(250mL三角瓶装50mL)中，28℃静止培养48 h。

孢子悬浮液的制备:种子液通过2层擦镜纸过滤，将菌丝体过滤除掉，收集的滤液为孢子种子液。

摇瓶发酵条件:10%接种量接入转化培养基中，回转式摇床150 r/min，30℃培养48 h后，加入洛伐他汀溶液，继续转化48h至发酵结束。

1.5 高效液相色谱紫外检测分析(LC-UV)

色谱柱为 Kromasil C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流动相为甲醇-0.5%乙酸(80∶20);流速为1mL/min;柱温25℃;进样量20μL;检测波长237 nm。

2 结果与分析

2.1 无锡他汀转化过程中pH产生的影响

pH是无锡他汀生物转化的主要影响因素之一，利用HPLC对转化过程的产物和pH进行测定，发现产物Ⅰ形成期最适pH呈弱碱，无锡他汀出现和累积处于pH为酸性阶段，pH大约在20h以后开始下降。2产物生成过程及pH变化如图1所示。

图1 两产物生成过程HPLC分析图

2.2 发酵过程中的pH值两段控制

由于发酵过程中2种产物产生时的pH有所不同，研究根据报道尝试采用pH值两阶段控制策略［5］。

在产物生成的发酵过程中，在无锡他汀形成初期将发酵液 pH 值调节为 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，发酵结束后取样检测。

结果表明(图2)，pH值调至偏酸性时，无锡他汀的转化率与偏碱性时相比有提高，这与无锡他汀需在偏酸性条件下形成的推论相同，而且当pH值调节为5.5时，转化率比自然发酵提高了3%。由此可见在发酵转化过程中调节pH对于无锡他汀的转化有利。

图2 pH值对无锡他汀转化率的影响

2.2 菌液补加与pH值协同调节

为进一步提高产物I向无锡他汀的转化，缩短由于菌体在pH值变化时的生理调整期，在发酵中调节pH值的同时补充新鲜的菌液，结果如图3所示。

图3 加入新鲜菌液并调节pH值对无锡他汀转化率的影响

结果表明，转化率最高出现在pH值5.5，转化率比对照提高4%。原因可能是新加入的菌体没有经过产物Ⅰ形成期弱碱性环境中的培养期，无法直接发挥转化作用，或以上因素对于发酵转化率有一定影响，但并非主要影响因素。

2.3 分离式分段调节pH值

为了进一步提高产物转化率，采取了分离式分段发酵模式:将孢子悬浮液按10%的接种量接入转化培养基一号中，回转式摇床30℃培养48 h后，加入洛伐他汀溶液，转化20 h后将发酵液在4℃下8 000 r/min离心，取上清液。利用大孔吸附树脂分离提纯产物Ⅰ，收集富集产物的洗脱液旋转蒸发并微孔过滤除菌备用。将提纯的产物Ⅰ作为底物再次转化15 h，生成无锡他汀。

检测结果表明，无锡他汀的生成率有明显提高。进一步研究pH值对2种产物的形成影响:在底物转化第1阶段和第2阶段，即产物Ⅰ生成期和无锡他汀生成期，将转化培养基的pH值分别调成4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。

由图4可见，2个阶段的最适pH值有较大差异。产物Ⅰ的形成阶段最适pH值为7.5，原因可能是大多。单加氧酶的最适pH值均在中性或偏碱性［6－7］;而无锡他汀形成期pH值为5.5时，与原发酵方法相比，转化率也提高了13%，同时由产物Ⅰ转化为无锡他汀的时间明显缩短。因此，分离式分段发酵模式具有较明显的优势。

图4 pH值对两步转化过程的影响

2.4 金属离子对两步转化过程的影响

金属离子是微生物生长过程中所需要的微量元素，对菌体的生长及部分酶的活性都有一定的影响［8－9］。实验考察了在发酵培养基中添加部分金属离子对两步转化过程的影响情况。

图5 金属离子对两步转化的影响

由图可见，Fe2+、Mg2+和Cu2+对于两步转化均有一定的促进作用。其中Fe2+是许多单加氧酶所含血红素的组成部分，添加该离子有利于氧的结合和电子传递，从而提高产率［10］;Mg2+和 Cu2+则有利于酶的稳定。3种对发酵有促进作用的金属离子对于2种产物的最适添加量有所不同，2个阶段分别通过3因素3水平正交试验进一步确定2种产物生成时上述3种金属离子添加量(表1)。

表1 正交试验结果

最终结合pH值调节及金属离子的添加，在分离式分段发酵模式下，无锡他汀的转化率提高了15%。

3 讨论

本研究通过改进获得了分离式分段发酵转化无锡他汀的方法，即第一阶段在pH为7.5、c［Fe2+］浓度0.857 mmol/L、c［Mg2+］0.257 mmol/L和c［Cu2+］0.040 mmol/L的转化培养基发酵产物Ⅰ，产物Ⅰ经分离提纯由已培养好菌体在 pH 为 5.5，c［Fe2+］1.429 mmol/L、c［Mg2+］0.429 mmol/L和c［Cu2+］0.040 mmol/L 的发酵条件下生成无锡他汀。此发酵模式使得无锡他汀的转化率较原有传统发酵模式提高了15%。

pH值作为影响发酵水平的重要理化因素，在不同微生物甚至同一微生物的不同生长阶段对生物生长代谢起重要作用，pH值的调节是优化发酵的主要手段。对于存在中间产物的发酵过程，为了提高目标产物的产量而通常采用改变发酵条件，研究主要集中在发酵过程中不同阶段的条件调节［5］，即分段控制发酵。对于需要利用不同菌通过二步或三步顺序发酵生产目标产品的工艺称为分步发酵，例如两步法发酵生成1，3-丙二醇［11］。本文以同一菌株两步不同pH值和离子浓度进行分离发酵生产无锡他汀取得了良好的效果，这种发酵模式可以为生成过程中存在中间产物积累且转化条件存在差异的的发酵过程的优化提供借鉴。

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［3］于海.Amycolatopsis sp.的筛选及其转化洛伐他汀的研究［D］.江南大学生物工程学院，2004

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Studies on Separative Subsection Fermention of Wuxistatin

Mou Lin，Zhuge Bin，Fang Hui-ying，Zhuge Jian
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education Research Center of Industrial Microorganisms，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Wuxistatin was a novel inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutary(HMG)-CoA reductase which was the rate-limiting enzyme in the process of cholesterol synthesis.Amycolatopsis sp.ST2710 could convert lovastatin into wuxistatin.ProductⅠ，as the intermediate，was the key factor of producing wuxistatin.It was found that two products had different optimum pH.To increase the yield，the study took pH as the main factor to investigate by three ways:adjusting pH during fermentation;adjusting pH cooperated with adding fresh bacteria solution;separative subsection fermentation.Finally we found that the separative subsection fermentation had the best result.So the method was introduced:firstly，productⅠwas formed from lovastatin，pH 7.5 and pured by macroporous resin;then the conditions of fermentation were changed to pH 5.5 for transferring pured productⅠto wuxistatin.At the same time，the effect of some metal ions on transformation was studied and the result showed that Fe2+，Mg2+and Cu2+could improve fermentation level.By this way，the convertion would increase by 15%，the time was shorten by a big margin and the final product would be more easily to purify.The fermentation pattern that based on one strain could provide reference for the study of fermentation with intermediate product and long-time fermentation.

Wuxistatin separative，subsection fermentation with one strain，pH control strategy

硕士研究生(诸葛斌教授为通讯作者)。

2010－09－05