基于强制渗透法制备天然水溶性壳聚糖的研究*

刘廷国，王彬彬，査萍萍，陈建，李斌

1(华中农业大学食品科技学院，湖北武汉，430070)2(池州学院化学与食品科学系，安徽池州，247100)3(池州市食品药品检验所，安徽池州，247000)

基于强制渗透法制备天然水溶性壳聚糖的研究*

刘廷国1，2，王彬彬1，査萍萍3，陈建1，李斌1

1(华中农业大学食品科技学院，湖北武汉，430070)2(池州学院化学与食品科学系，安徽池州，247100)3(池州市食品药品检验所，安徽池州，247000)

制备非衍生化高相对分子质量水溶性壳聚糖对材料创新及应用具有重要的意义。采用真空强制渗透法，使浓碱强制渗透入甲壳素颗粒的微孔中，加速甲壳素的溶胀以及NaOH的传质，形成近似均相的脱乙酰环境。通过控制脱乙酰度在50%左右，即可获得水溶性壳聚糖。表观黏度、红外光谱、X－射线衍射、差示扫描量热分析表明:制备的水溶性壳聚糖与传统壳聚糖无本质差异;所不同的是，强制渗透法制备的产品呈非晶态，分子间氢键作用较弱，因而具有良好的水溶性。

强制渗透，水溶性壳聚糖，均相脱乙酰，非衍生化

壳聚糖是甲壳素［1－3］的部分 N－脱乙酰产物，由性质活泼的伯胺基取代了化学惰性的乙酰氨基，使壳聚糖具有良好的生物相容性、广谱抗菌性、生物可降解性、重金属离子螯合性、成膜性和成纤维性等［4－5］，因而使甲壳素、壳聚糖及其衍生物在生物医用材料、废水处理、纺织印染、食品、化妆品和农业等领域均有很高的应用价值［6－7］。然而由于稳定的结晶结构致使甲壳素和壳聚糖不能溶于中性水溶液，也不能溶于一般有机溶剂，这极大地制约了其应用［8－9］，有效解决其溶解性问题，成为备受关注的热点之一［10－11］。

目前，水溶性壳聚糖的制备主要有3种途径:(1)在温和的均相条件下，利用甲壳素脱乙酰化或壳聚糖乙酰化，控制脱乙酰度(degree of deacetylation，DDA)在50%左右即可获得水溶性壳聚糖［12－13］;(2)利用甲壳素分子结构中的羟基和氨基的反应活性，在其分子主链上引入亲水基团，通过化学修饰得到水溶性衍生物［14］;(3)通过超声、高能射线辐射、酶水解等物理或化学方法降解壳聚糖得到低分子质量的水溶性产物［10，15－16］。然而只有第一种方法制备的产物才是真正意义上的水溶性壳聚糖。但由于均相反应条件不易控制，后处理冗长繁琐，需要消耗大量有机溶剂等缺点，导致该方法难以推广［17］。本研究在传统制备方法的基础上利用真空将NaOH强制渗透进甲壳素颗粒内部，创造近似均相的环境，从而制备非衍生化水溶性甲壳素。

1 实验部分

1.1 实验材料与设备

甲壳素(食品级，DDA=21.11%，过80目筛)，浙江金壳生物化学有限公司;壳聚糖(DDA=87.5%，Mη =6.95×105，80目)、除特别说明外，实验用水均为双蒸水，所用化学试剂均为分析纯。

数字旋转黏度计(NDJ－8S)，上海精密科学仪器有限公司;数显恒温水浴锅(HH－4)，国华电器有限公司;真空干燥箱(DZF－6050)，上海精宏实验设备有限公司;冷冻离心机(BC－010_TY2265)，美国Beckman公司;分析天平(AC2105)，德国Sartorius公司;循环水式多用真空泵(SHB－III)，郑州长城科工贸有限公司;X－射线衍射仪(D/Max－IIIA)，日本 Rigaku公司;红外光谱仪(NEXUS 470 FT－IR)，美国 Nicolet公司;差示扫描量热仪(204－F1)，德国Netzsch公司。

1.2 水溶性壳聚糖的制备

参照文献［18－19］方法并作适当修改，称取5g甲壳素样品与质量分数45%的NaOH溶液按1∶5(g∶mL)的比例混合均匀，真空脱气至无气泡产生，－0.1 MPa真空度下维持3h，于40、60、84℃条件下恒温搅拌15、20、30、45、60 min，迅速冷却至室温，以4 000 r/min离心20 min以除去多余的NaOH溶液，沉淀用体积分数70%乙醇洗涤至用0.1mol/L AgNO3检测无Cl－残留，再分别用体积分数95%乙醇、无水乙醇脱水，60℃真空干燥24 h，取出研磨置干燥器备用。

1.3 脱乙酰度和水溶性测定

脱乙酰度按文献［19］报道方法进行测定。样品水溶性采用滤纸称重法测定［17］。将100.0 mg干燥样品分散至 10mL去离子水中，4℃搅拌 24 h，用0.45μm滤纸过滤、洗涤、干燥。样品水溶性用滤纸前后质量之差比上样品质量来表示。

1.4 表观黏度

分别称取一定质量壳聚糖和水溶性样品，分散至0.1mol/L乙酸溶液中，室温搅拌4h使其充分溶解，配置浓度为1%、1.5%、2%、2.5%、3%的壳聚糖乙酸溶液，以NDJ－8S数显黏度计(3号转子，30r/min)测量其表观黏度。取浓度为1%的壳聚糖和水溶性壳聚糖(WSC)乙酸溶液，分别置 30、40、50、60、70℃恒温水浴保温30 min，取出立即测定表观黏度，评价温度的影响。取一定质量的WSC分别用去离子水配置成浓度为 0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% 的溶液，按前述方法测定表观黏度。

1.5 结构表征

粉末X－射线衍射图谱由X－射线光谱仪获得，测定条件为 20℃，35kV，30mA，石墨单色器，DS/SS=1°，RS=0.3 mm，采用 Cu Kα1 辐射 λ =1.54184Å。扫描角度(2Theta，2θ，°)范围为 4～60°，步进 0.02°，每分钟 4°［20］。

傅立叶变换红外光谱(FT－IR)由FT－IR光谱仪在室温、干燥条件下扫描获得，扫描范围为4 000～400cm－1，分辨率4cm－1，累加 32 次，以空气为背景，每个样品扫描前扣除背景［21］。

差示扫描量热(differential scanning calorimetry，DSC)仪用纯金属铟(99.99%)校正温度和热焓，准确称取(5.0±0.1)mg样品放入盖子中心带孔的铝坩埚中，密封，用相同的空坩埚作参比，以20℃/min升温速率从30℃升至190℃，恒温5 min。快速冷却后重新称量，再以10℃/min从30℃升温至500℃，整个过程均在干燥N2下进行，吹扫气流量20mL/min，保护气流量 60mL/min［22－23］。

2 结果与分析

2.1 水溶性壳聚糖的制备

传统的甲壳素脱乙酰反应可视为典型的液固复相反应，符合准一级反应动力学方程。由于甲壳素的强氢键相互作用，导致颗粒内部无法与高浓度的NaOH充分接触，致使局部未脱乙酰化，脱乙酰过程主要集中在甲壳素的无定形区域，乙酰基团在分子链上呈块型(block－type)分布，溶解度较差。本研究借助真空的作用强制NaOH渗透进甲壳素颗粒内部，形成近似均相的环境，从而使脱乙酰反应能够均匀进行。

图1反映了反应温度和时间对甲壳素脱乙酰进程的影响。随反应温度的提高，脱乙酰度逐渐增大。温度越高，分子运动性越强，NaOH与反应物活性基团间的碰撞越充分，反应速度越快。此外，脱乙酰反应是吸热反应，升高温度，甲壳素的脱乙酰化反应速率提高，达到相同脱乙酰度所需的反应时间缩短。但温度也不能过高，否则导致脱乙酰速度过快，无法使乙酰基和氨基均匀分布。反应温度为40℃和60℃的样品，随处理时间的延长脱乙酰度呈线性递增，反应符合准一级反应动力学方程［19］。反应温度为84℃的样品，反应时间45 min以内呈线性递增，在整个范围内则呈指数增长。

图1 温度和时间对甲壳素脱乙酰反应的影响

对产物的水溶性测定结果显示，只有84℃处理45 min的样品(DDA=51.92%)能够在纯水中部分溶解(Ws=69.72%)，其他样品只能溶胀或溶解极少部分。该样品在水中溶解度大幅提高的原因可能是，由于甲壳素颗粒内部存在大量微小空隙，使高浓度的NaOH溶液很难穿过这种气孔屏障，利用真空强制渗透能够打破这种气孔阻塞的状祝，使NaOH逐步扩散至颗粒内部乃至核心区域，使甲壳素在近似均相的条件下脱乙酰，此时得到的壳聚糖是葡糖胺单元与乙酰葡糖胺单元的无规共聚物，氨基(—NH2)和乙酰氨基(—NHCOCH3)呈无序分布，氢键相互作用减小，从而使产物具有良好的水溶性。相反，其他条件制备的壳聚糖，由于乙酰胺基的分布不够均匀，分子间作用较强，无法在纯水中溶解。

2.2 壳聚糖和WSC溶液表观黏度(η)分析

2.2.1 浓度对表观黏度的影响

高分子聚合物溶液根据其浓度可划分为极稀溶液、稀溶液、亚浓溶液和浓溶液。在不同的浓度区间，其分子之间存在明显不同的相互作用，这种作用直观地反映在高聚物的表观黏度上。通过表观黏度的测定还可以粗略的反映样品分子量的大小。图2为不同浓度壳聚糖和WSC乙酸溶液的表观黏度，利用幂函数拟合，相关系数较好，两者表观黏度无显著性差异。说明制备的水溶性壳聚糖与商品壳聚糖相似似，分子量比较接近，均为中黏度壳聚糖，在作为膜材料、增稠等方面使用更为方便。这与低分子质量水溶性壳聚糖相比为一显著优势。

图2 不同浓度壳聚糖和水溶性壳聚糖乙酸溶液的表观黏度

2.2.2 WSC 水溶液的表观黏度

与稀乙酸相比，水为壳聚糖的不良溶剂，传统方法制备的壳聚糖无法溶解，本研究制备的水溶性壳聚糖在水中从溶胀到溶解的过程亦较长。溶解时黏度亦较大，随浓度的提高，黏度急剧增大，配制3%浓度以上的溶液十分困难。用指数函数A1×exp(－x/t1)+y0拟合表观黏度与浓度的关系曲线如图3所示。浓度为1%的水溶液的表观黏度约为同浓度稀酸溶液的20倍。可能是在2种溶剂中，水溶性壳聚糖分子的远程结构不同导致的。在稀酸中壳聚糖以盐的形式存在，氢键作用大大减弱，黏度降低，假塑性流体特征不明显。而在水溶液中壳聚糖分子间氢键相互作用强烈，分子相互缠绕，内摩擦力增大，黏度随之提高，假塑性流体特征明显。

图3 不同浓度水溶性壳聚糖水溶液的表观黏度

2.2.3 温度对表观黏度的影响

图4反应温度对壳聚糖和水溶性壳聚糖表观黏度的影响。温度是分子无规则热运动激烈程度的反映，温度升高，分子热运动加剧，分子间距增大，材料内部自由体积增多，使链段更易于活动，内摩擦减少，黏度下降。相比而言，水溶性壳聚糖和商品壳聚糖的乙酸溶液黏度对温度的敏感性相似，进一步说明，以乙酸为溶剂时，二者在应用上相似。经幂函数拟合后(如图4)，水溶性壳聚糖对温度的敏感性稍弱，说明在WSC在某些方面比传统壳聚糖更优越。

图4 温度对壳聚糖和水溶性壳聚糖表观黏度的影响

2.3 水溶性壳聚糖结构表征

2.3.1 红外光谱分析

甲壳素和壳聚糖的主要差别在于，其所含酰胺基团和伯胺基团的量不同，这一差别能够在红外光谱中反映出来。图5分别给出了甲壳素、壳聚糖和WSC的FT－IR图谱。WSC 3 446cm－1附近代表O—H和N—H伸缩振动的吸收峰变宽并向低波数方向移动。波数为3 267和3 103cm－1代表N－H伸缩振动(酰胺Ⅲ带)的吸收峰明显减弱，几乎不可见。这2个吸收峰与C(2s1)NH…O=C(73)和C(61)OH…HOC(62)分子内氢键作用关系密切［9］，可见，利用强制渗透法制备的WSC分子内氢键作用明显减弱。与甲壳素相比，1 660(酰胺Ⅰ)、1 560(酰胺Ⅱ)和 1 310cm－1(酰胺Ⅲ)处3个酰胺(HN－C=O)的3个特征吸收峰有所减弱，但强于壳聚糖。波数为1 070和665cm－1处的红外吸收是壳聚糖的结晶敏感吸收带［24］，水溶性壳聚糖在该处的吸收明显变宽、变弱，说明水溶性壳聚糖结晶性较差，而其他样品在该处均有明显的红外吸收。

2.3.2 X 射线衍射分析

图6为甲壳素、壳聚糖和水溶性壳聚糖的X射线衍射图谱。甲壳素在整个扫描范围有非常强的尖锐衍射峰，这是由于甲壳素分子链的规整性好并且具有刚性，可以形成较强的分子内和分子间氢键，使得甲壳素具有较好的结晶结构。壳聚糖在扫描范围内也有2个较强的衍射峰。而水溶性壳聚糖在整个扫描范围内只有一个宽化的、弥散的、无定形峰，说明水溶性壳聚糖的结晶性显著下降，分子间的氢键作用明显减弱，扰乱了分子排列的规整性，导致刚性减弱，水溶性增加。强制渗透法制备的水溶性壳聚糖结晶性较差的主要原因，是在近似均相条件下脱乙酰化反应是随机进行的，每个甲壳素环上的乙酰氨基发生反应的几率是相同的，因此得到的产物是葡糖胺单元与乙酰葡糖胺单元的无规共聚物。而在非均相条件下，甲壳素脱乙酰反应首先发生在非晶区，因此得到的产物是葡糖胺单元与乙酰葡糖胺单元的嵌段共聚物，产物仍然具有较好的结晶性。

图5 甲壳素、壳聚糖和水溶性壳聚糖的红外光谱图

图6 甲壳素、壳聚糖和水溶性壳聚糖的X射线衍射图

2.3.3 热特性分析

图7是甲壳素、壳聚糖和水溶性壳聚糖的DSC及其一阶微分曲线(DDSC)。甲壳素的热分解过程是典型的吸热过程，壳聚糖和WSC则是典型的放热过程。甲壳素的分解峰值温度为397.80℃，峰型较宽。而壳聚糖和WSC则出现尖锐的放热峰，峰值温度分别为310.54℃和297.03℃。与甲壳素相比，分解峰值温度大大提前，说明热稳定性比甲壳素差得多。可能是由于壳聚糖中较多自由胺基的存在导致热稳定性降低，另一方面也可能因为分子柔性的增强，链段运动的增强而导致热分解速度显著加快。水溶性壳聚糖的分解温度明显低于壳聚糖，可能是由于水溶性壳聚糖分子中氨基和乙酰胺基的无规分布导致结晶性比壳聚糖低得多，分子内和分子间的相互作用力也相对较弱，热稳定性变差。

图7 甲壳素、壳聚糖和水溶性壳聚糖的DSC(DDSC)图谱

3 结论

在真空条件下将浓碱强制渗透入甲壳素颗粒的微孔中，有利于加速甲壳素的溶胀以及NaOH的传质过程，达到近似均相的脱乙酰状态。控制脱乙酰度在50%左右，所得壳聚糖具有良好的水溶性。该产物与商品壳聚糖在表观黏度、黏均分子质量、热分解行为等方面无显著差异。水溶性壳聚糖热分解温度提前，结晶性降低，说明水溶性壳聚糖可能是葡糖胺单元与乙酰葡糖胺单元的无规则共聚物，氨基和乙酰氨基呈无序排列，分子内与分子间的相互作用力减小，导致热稳定性降低，水溶性大幅提高。说明强制渗透法是一种较简便、高效的制备水溶性壳聚糖的新方法，值得进一步深入研究和开发。

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Prepartion and Characterization of a Natural Water-soluble Chitosan on Forced Penetration Method

Liu Ting－guo1，2，Wang Bin－bin1，Zha Ping－ping3，Chen Jian1，Li Bin1
1(College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)2(Department of Chemistry and Food Science，Chizhou College，Chizhou 247100，China)3(Chizhou Institute for Food and Drug Control，Chizhou 247000，China)

Preparation of nonderived water－soluble chitosan with high molecular weight is of great significance to the innovation of materials and its application.In this paper，the forced penetration method for preparing a natural water－soluble chitosan have been investigated.Under the action of vacuum，the concentrated alkali was forced to infiltrate into the micropore of chitin particles.This has accelerated the swelling of chitin，as well as the mass transfer process of NaOH，and thus form an approximate homogeneous environment of deacetylation.By controlling the degree of deacetylation of about 50%，a water－soluble chitosan(WSC)can be obtained.The apparent viscosity，FT－IR，X－ray diffraction(XRD)and differential scanning calorimetry(DSC)were applied to estimate the structure and properties of WSC.The results showed that water－soluble chitosan and the traditional chitosan have no essential difference.The difference is that the WSC prepared with forced penetration method has more amorphous structure，weakened intermolecular hydrogen bonds and good water solubility.

forced penetration，water－soluble chitosan，homogeneous deacetylation，nonderived

硕士，讲师(李斌教授为通讯作者)，E－mail:Libinfood@mail.hzau.edu.cn)。

*国家“863”资助项目(2007AA10Z310);2011年度安徽高等学校省级自然科学研究一般项目和池州学院化学材料与工程省级实验中心建设项目资助

2010－06－30，改回日期:2010－10－28