响应面分析法优化HS-SPME萃取黄豆酱挥发性成分工艺研究

乔 鑫，黄红霞，乔 宇，康 旭，李冬生,2,*

(1.湖北工业大学生物工程学院，湖北 武汉 430068；2.湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068；3.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064)

响应面分析法优化HS-SPME萃取黄豆酱挥发性成分工艺研究

乔 鑫1，黄红霞1，乔 宇3，康 旭1，李冬生1,2,*

(1.湖北工业大学生物工程学院，湖北 武汉 430068；2.湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430068；3.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北 武汉 430064)

为了优化黄豆酱挥发性风味成分检测的SPME萃取效率，采用Plackett-Burman设计法和响应面分析法对黄豆酱风味萃取条件进行优化。先用Plackett-Burman设计从8种萃取因素中筛选出对总峰面积有显著影响的因素，再用最陡爬坡试验及Box-Behnken设计进一步优化。结果表明，萃取温度、萃取时间和基体中的无机盐添加量是影响总峰面积的显著因素，优化后的萃取条件为萃取温度56℃、萃取时间42min、基体中的无机盐添加量0.98g。在优化条件下，与初始最大总峰面积12880000相比，总峰面积提高到13107129。

豆酱；响应面法；条件优化；HS-SPME

Abstract：In order to enhance the extraction efficiency of soybean paste flavor components, Plaekett-Burman design and response surface methodology were used to optimize extraction conditions. Eight factors were evaluated by Plackett-Burman design on the basis of total peak area and further optimization was performed by Box-Behnken experiments. Results showed that extraction temperature, extraction time and the addition amount of inorganic salts played important roles in the extraction of essential flavor components. The optimal extraction parameters were extraction temperature of 56 ℃, extraction time of 42 min and sodium chloride addition amount of 0.98 g. Under the optimal extraction condition, the total content of volatile flavor components was significantly improved according to the increase of total peak area from 12880000 to13107129.

Key words：soybean paste；response surface methodology；technology optimization；HS-SPME

黄豆酱(soybean paste)在我国有着悠久的历史，是人民生活中不可缺少的调味品，风味又是调味品至关重要的品质特性，对其研究有着必要的意义[1]。但目前存在的主要问题之一是挥发性成分提取手段有局限性，很难真实反映产品气味组成。近几年顶空固相微萃取(HSSPME)作为一种新的挥发性物质采样技术被广泛应用，它通过吸附/脱附技术，主要富集样品中的挥发和半挥发性成分，灵敏度高、重现性及线性好、操作简单方便快速并能较真实地反映样品特别是活体样品的风味组成[2-3]。Gianelli等[4]和徐琳娜等[5]对黄豆酱香气成分的萃取做过研究，但黄豆酱萃取工艺的优化研究还未见报道。基于此，本研究采用顶空固相微萃取并结合响应面法优化萃取条件，以提高黄豆酱香气的萃取效率。

东北豆酱不仅在原料上为当地精选品种，而且酱香浓郁。本研究以东北知名酱业生产的优质豆酱作为研究对象，通过因素筛选，最终选取萃取温度、萃取时间和基体中的无机盐添加量3个因素进行响应面设计，利用响应面法优化黄豆酱香气的最佳萃取工艺参数，以期为黄豆酱香气成分研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑龙江省某知名酱业公司生产，样品保存于密封袋中，4℃冷藏备用。

1.2 仪器与设备

固相微萃取(SPME)装置：萃取头DVB/CAR/PDMS 50/30μm(二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷) 美国Supelco公司；GC-2014AFSPL气相色谱仪 日本岛津公司；7890N/5975MSD风味检测气质联用仪 美国Agilent公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄豆酱挥发性成分的测定

称取一定量酱醅，并与一定量无机盐(NaC1)和一定去离子水体积混合均匀后加入15mL样品瓶中，将样品瓶放入一定温度的水浴中平衡5min，再将已老化好的萃取针头插入样品瓶中，用手柄将石英纤维头推出暴露到样品瓶顶空气体中，恒温萃取一段时间，用手柄将纤维头推回针头内，将萃取针头拔出，插入GC-MS进样器中解析一定时间。

1.3.2 萃取头老化

将DVB/CAR/PDMS 50/30μm固相微萃头在气相色谱的进样口老化至无杂峰，老化温度270℃，老化时间1h[6]。

1.3.3 GC-MS参数条件

色谱柱：RTX-1毛细管色谱柱(30.0m×0.25mm，0.25μm)；升温条件：柱温40℃保持1min，以5℃/min上升到130℃，保持1min，再以8℃/min上升到250℃，保持1min；进样口温度为250℃；FID检测器温度为300℃；载气N2，流速30mL/min；燃气H2，流速300mL/min；助燃气空气，流速400mL/min；分流比5.0。

1.4 优化试验设计

1.4.1 Plackett-Burman

设计在优化初期利用Plackett-Burman设计法[7]，对影响固相微萃取的8个因素进行考察。萃取温度(X1)、萃取时间(X2)、解析时间(X3)、搅拌速度(X4)、样品质量(X5)、去离子水体积(X6)、基体中的无机盐添加量(X7)、pH值(X8)，分别作为PB试验设计的8个因素，每个因素取两个水平，即低水平(－1)和高水平(+1)，总峰面积作为响应值Y[8]。

1.4.2 最陡爬坡试验

响应面拟合方程只有在考察的紧接邻域里才充分近似真实结果，故只有先逼近最大目标产物产量区域后才能建立有效的响应面拟合方程[9]。根据PB试验筛选出的对峰面积影响显著的因素，以各显著因素的正负效应确定最陡爬坡试验的路径(包括变化方向和变化步长)，快速的逼近最大响应区域。

1.4.3 Box-Behnken设计

以PB试验筛选得到的对总峰面积影响显著的因素作为设计因素，以最陡爬坡试验得出的浓度作为中心点，根据相应的试验表进行试验后，使用SAS 9.0对试验结果进行响应面分析[10]。

2 结果与分析

2.1 影响因素的筛选

按照Plackett-Burman试验设计，对影响固相微萃取萃取条件的8个因素进行考察，Plackett-Burman试验设计[8]及结果见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计与结果Table 1 Design and results of Plackett-Burman experiments

表2 Plackett-Burman试验设计各因素水平编码及影响效果Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡试验

由2.1节可知，萃取温度有高度显著影响；萃取时间有显著影响；基体中无机盐添加量、解析时间、搅拌速度、样品质量、去离子水体积、pH值对总峰面积均无显著影响，但一般可信度大于90%可作为主要影响因素[11]，基体中无机盐添加量属主要影响因素。萃取温度和萃取时间对总峰面积有显著正效应，而基体中的无机盐添加量有显著负效应，这3个因素有待进一步研究。根据萃取温度、萃取时间和基体中无机盐添加量这3个因素效应大小的比率设定它们的变化方向及步长进行最陡爬坡试验，设计及结果处理见表3。由表3可知，随萃取温度、萃取时间、基体中无机盐添加量的变化，总峰面积呈先上升后下降，当萃取温度55℃、萃取时间40min、基体中的无机盐添加量0.8g时，所对应的总峰面积达到最大值，故以条件3为后续实验中心点，进行下一步优化试验。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Design and results of the steepest ascent experiments

2.3 最佳萃取条件的优化[12-14]

2.3.1 响应面分析因素水平的选取

在最陡爬坡试验的基础上，采用响应面设计，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理[15]，选择黄豆酱挥发性风味物质提取条件对总峰面积影响显著的3个因素，萃取温度(X1)、萃取时间(X2)和基体中无机盐添加量(X3)，做三因素三水平响应面分析试验，试验因素与水平设计见表4。

表4 响应面分析因素及水平Table 4 Factors and levels of response surface design

2.3.2 响应面优化方案

表5为响应面分析方案及实验结果，试验号1～12是析因试验，试验号13～15是中心试验。15个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。RSM软件对所得数据进行回归分析，回归分析结果见表6。

表5 响应面试验设计及相应结果Table 5 Design and results of response surface experiments

表6 回归方程方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

2.3.3 因素间的交互作用分析

图1结果显示了基体中的无机盐添加量取中心水平时，萃取温度和萃取时间对总峰面积的交互作用。从等高线图接近圆形可知交互作用不显著，随着萃取温度延长和萃取时间的增加，总峰面积在不断的增大，当萃取温度和萃取时间升高到一定程度后，响应值值达到最大；萃取温度和萃取时间继续升高时，总峰面积又会随之下降。说明萃取温度过高或过低和萃取时间过大或过小都不能使响应值达到最大值，只有它们取到某个适中值时，才可使总峰面积达到最大值。

图1 萃取温度(X1)和萃取时间(X2)对总峰面积(Y)的相应面图和等高线图Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature and extraction time on total content of volatile flavor compounds

图2 萃取温度(X1)和无机盐添加量(X3)对总峰面积(Y)的相应面图和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature and inorganic salt addition amount on total content of volatile flavor compounds

图2结果显示了萃取时间取中心水平时，萃取温度和基体中的无机盐添加量对总峰面积的交互作用。从等高线图接近椭圆形可知交互作用显著，在试验水平范围内总峰面积随萃取温度的增加呈现出先增加后略减小的趋势。原因可能是温度过低，未达到豆酱部分风味物质的沸点，高沸点的风味物质无法挥发出来，总峰面积相对较少；随温度升高，萃取头萃取分析能力降低，从而导致萃取头固有吸附组分会发生解吸[17]，总峰面积发生减少现象。

图3 萃取时间(X2)和无机盐添加量(X3)对总峰面积(Y)的相应面图和等高线图Fig.3 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction time and inorganic salt addition amount on total content of volatile flavor compounds

图3结果显示了萃取温度取中心水平时，萃取时间和基体中的无机盐添加量对总峰面积的交互作用。从等高线图接近椭圆形可知交互作用显著，萃取时间影响显著，在试验水平范围内，萃取时间的增加总峰面积呈明显的先增加后略减小的趋势。而基体中的无机盐添加量的增大，总峰面积缓慢增大后基本保持不变。原因可能是无机盐添加量增加有利于豆酱样品中风味物质的挥发，但到达一定程度后，豆酱样品中无机盐处于饱和状态[12]，于是总峰面积基本保持恒定。

2.4 豆酱挥发性风味物质萃取回归模型的建立及检验

对各因素回归拟合后，得到回归方程：

所得的回归方程能较好的预测豆酱挥发性风味物质萃取随各参数的变化规律，可以利用该回归方程确定最佳提取条件。对回归方程取一阶偏导数等于零，联立方程组解得：X1=0.14，X2=0.18，X3=1.8，即可换算得到萃取温度55.75℃、萃取时间41.8min、基体中的无机盐添加量0.98g。考虑到实际操作的便利，确定豆酱挥发性风味物质萃取条件为萃取温度56℃、萃取时间42min、基体中的无机盐添加量0.98g。由回归方程预测豆酱挥发性风味物质萃取条件理论总峰面积可达13107129。

表7 豆酱中鉴定出的挥发性化合物Table 7 Identified volatile flavor compounds in soybean paste

验证实验：在上述响应面分析结果确定的最佳条件下进行3次萃取实验，得到豆酱挥发性风味物质的平均总峰面积为13001025，与预测值13107129基本一致，说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面法适用于对豆酱挥发性风味物质萃取进行回归分析和参数优化。

2.5 酱样品中挥发性风味成分的分析检验

采用优化后的固相微萃取条件并结合气质联用测定了豆酱样品中的挥发性风味成分。豆酱样品中各挥发性风味成分的种类及相对含量见表7。

根据表7，豆酱样品中共鉴定出36种挥发性风味成分，这些成分包括酯类、醛类、酸类、醇类、酮类、酚类和含氮化合物等几类物质，可见此优化方法能较完全地萃取豆酱样品中的挥发性风味成分。从单个风味化合物检出频次看，典型风味化合物苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、棕榈酸甲酯、安息香醛、风信子醛[18]和4-乙基愈创木酚[6]均被检测到，且检测量较高。

酯类易挥发，人嗅觉对此类物质也比较敏感，因而酯类是发酵食品风味的重要组分；本优化方法共检出9种酯类，且这些酯类物质的气味强度适中，温和厚重，是豆酱香味的底蕴。醛类物质的阈值一般较低，对食品整体风味的贡献较大；检出的7种风味化合物无论种类还是总相对含量均较高。醇类化合物的风味阈值较高，对整体风味贡献较小，此方法仅检测出苯乙醇。酚类及含氮化合物由于其风味阈值很低，对黄豆酱的整体风味贡献很大，两类物质各检出5种风味物质。酸类、酮类及烷烃类为“风味物质前体库”，在后熟期间再经一系列复杂的发酵代谢和生化反应，这三类物质检出种类相对不多。该优化方法简便、快速、经济安全、无溶剂、选择性好且灵敏度高，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，大大加快了分析检测的速度，对大分子物质的吸附能力较强，能较好地体现出黄豆酱本身的风味特征，适于分析黄豆酱风味物质的组成。

3 结 论

实验证明响应面方法对豆酱挥发性风味物质萃取是非常有效的工具，Plackett-Burman试验设计能对影响总峰面积的各因素效应进行评价并能有效地找出主要因素，最陡爬坡法能充分接近最大响应面区域，B o x-Behnken试验设计能建立主要因素影响总峰面积的二次多项数学模型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了内在因素水平，找出最佳值。该研究经响应面方法优化，得出豆酱挥发性风味物质萃取的最佳工艺条件为萃取温度56℃、萃取时间42min、基体中的无机盐添加量0.98g。在优化条件下经3次萃取实验验证，预测值与验证实验平均值接近，与初始最大总峰面积12880000相比，总峰面积有所提高，达到13107129；且优化方法能较好地体现出黄豆酱本身的风味特征，适于分析黄豆酱风味物质的组成。

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Optimization of HS-SPME Extraction for Volatile Flavor Compounds from Soybean Paste by Response Surface Methodology

QIAO Xin1，HUANG Hong-xia1，QIAO Yu3，KANG Xu1，LI Dong-sheng1,2,*
(1. College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China；2. Food Fermentation Engineering and Technology Research Center of Hubei, Wuhan 430068, China；3. Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China)

TS207.3

A

1002-6630(2010)22-0069-06

2010-07-23

湖北省科技厅重大攻关项目(鄂财企发[2007]119号)

乔鑫(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物技术。E-mail：qiaoxinspring@163.com

*通信作者：李冬生(1961—)，男，教授，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：dongshengli86@163.com