甲硝唑诺氟沙星栓微生物限度检查方法研究

周修森，李道明

（河南省信阳市食品药品检验所，河南信阳 464000）

甲硝唑诺氟沙星栓是河南信阳职业技术学院附属医院制剂室配制的外用制剂，以甲硝唑和诺氟沙星为主药、硬脂酸聚烃氧（40）酯为基质混合制成的栓剂。其中甲硝唑对大多数厌氧菌具强大抗菌作用，对阿米巴原虫和滴虫也有较强的杀灭作用，诺氟沙星为第三代喹诺酮类抗菌药物，具有抗菌谱广、作用强等特点。临床用于治疗阴道滴虫、阴道炎，各种阿米巴病及术后预防和治疗厌氧菌引起的感染等。本文按照《中国药典》2005年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法[1]有关要求，对甲硝唑诺氟沙星栓微生物限度检查方法的建立进行探讨。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HTY-Ⅲ智能集菌仪、HTY反复使用集菌培养器（杭州泰林医疗器械厂）；YJA型电动匀浆仪（台州市椒江五星机械仪器有限公司）；lRH-150B型生化培养箱（广东省医疗器械厂）；电热三用水箱（北京市医疗设备厂）；JM3102电子天平（余姚纪铭称重校验设备公司）。

1.2 试药

甲硝唑诺氟沙星栓（规格：3.4 g，批号：20090311，河南信阳职业技术学院附属医院制剂室提供）；大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均购自河南省食品药品检验所，菌株传代数均为第4代；营养琼脂培养基（批号：070328）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号：070531）；营养肉汤培养基（批号：070508）；改良马丁培养基（批号：070302）；胆盐乳糖培养基（批号：070419）；改良马丁琼脂培养基（批号：070520）；甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号：080520）；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号：070620）均为北京三药科技开发有限公司生产；pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：070523，北京三药科技开发有限公司）；吐温-80、硫酸锰为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

分别取经37℃培养18～24 h的大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养物1 ml，经25～28℃培养18～24 h的白色念珠菌的改良马丁液体培养物1 ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释成每毫升含菌数50～100 cfu的菌悬液；取经25～28℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，用5 ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，吸孢子悬液1 ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量，稀释成与标准比浊管浊度相当的孢子悬液，取1 ml孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释成每毫升含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。

2.2 供试品溶液制备[2]

取供试品10 g，加45℃无菌含1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（以下简称稀释液）100 ml，置匀浆仪匀浆，1档2 min，制成1∶10的供试品溶液。

2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数法的验证

2.3.1 试验组 常规法、培养基稀释法分别取供试品溶液1.0、0.5和0.2 ml，注入平皿，分别加50～100 cfu的试验菌，立即倾注相应的琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按规定培养及测定其菌落数；薄膜过滤+中和法取供试品溶液1 ml，加至100 ml 45℃无菌含0.1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（以下简称冲洗液）中，滤过，再用冲洗液冲洗3次，每次100 ml，在最后一次冲洗液中加入50～100 cfu的试验菌，过滤后取出滤膜，将滤膜冲洗面朝上贴至含有5 ml中和剂（0.1 mol/L的MnSO4）的营养琼脂培养基平板上培养，每种试验菌制备2张膜，置规定温度培养24～48 h，计数。

2.3.2 菌液组 测定加入的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组 取供试品溶液，按试验组的方法，不加入试验菌，按菌落计数法测定供试品本底菌数。

2.3.4 稀释剂对照组 制备供试品溶液和冲洗时，都加入了吐温-80，选择稀释液代替供试品溶液，按试验组常规法试验。

2.3.5 回收率的测定 计算公式如下，结果见表1。

表1 加菌回收率试验结（%）

2.4 控制菌检查方法的验证[3]

2.4.1 试验组 取供试品溶液10 ml，加至250 ml冲洗液中，滤过，再用冲洗液冲洗3次，每次100 ml，在最后一次冲洗液中加入50～100 cfu的金黄色葡萄球菌（或铜绿假单胞菌），过滤后，灌注100 ml含有5 ml中和剂的营养肉汤培养基（或胆盐乳糖培养基），培养18～24 h后，划线于甘露醇氯化钠琼脂培养基（或溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基）的平板上，依照金黄色葡萄球菌（或铜绿假单胞菌）的检查方法进行检查。

2.4.2 阴性菌对照组 加入菌改为大肠埃希菌，其余操作同试验组。

2.4.3 阳性对照组 取50～100 cfu的金黄色葡萄球菌（或铜绿假单胞菌）加至100 ml含有5 ml中和剂的营养肉汤培养基（或胆盐乳糖培养基）中，依法培养，按试验组同法检查。

2.5 结果

2.5.1 由表1结果可知，用培养基稀释法白色念珠菌、黑曲霉菌的加菌回收率可达到70%，提示可以用培养基稀释法进行该供试品的霉菌、酵母菌计数测定；用薄膜过滤+中和剂法培养计数，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的加菌回收率均在70%以上，提示可以用该法对细菌数进行测定。

2.5.2 控制菌检查方法验证结果 试验组、阳性对照组均呈阳性，阴性菌对照组均未检出阴性菌。试验组呈阳性表明试验菌能够正常生长；阴性菌对照组未检出阴性菌表明试验菌对其相对应的增菌液或琼脂培养基具有专属性。因此，该控制菌检查可采用薄膜过滤冲洗后，在含有中和剂的增菌培养基中培养，依法检查。

2.6 微生物限度检查方法的建立

根据上述实验结果，甲硝唑诺氟沙星栓微生物限度检查方法为：照微生物限度检查法（附录Ⅺ J），取供试品10 g，加45℃无菌含1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，置匀浆仪匀浆，1档2 min，制成1∶10的供试品溶液。

细菌数计数测定：取供试品溶液1 ml，加至100 ml 45℃无菌含0.1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，按薄膜过滤法（冲洗量300 ml/膜），将滤膜贴至含有5 ml中和剂（0.1 mol/L的MnSO4）的营养琼脂培养基平板上，依法测定；霉菌和酵母菌计数测定：取供试品溶液按培养基稀释法依法测定。

控制菌检查：取供试品溶液10 ml，加至250 ml 45℃无菌含0.1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，按薄膜过滤法（冲洗量300 ml/膜），灌注含5 ml中和剂的100 ml相应培养基，依法检查。

3 讨论

该制剂有较强的抗细菌作用，消除抑菌成分的有效方法是薄膜过滤，但所制备的供试品溶液必须能顺利通过滤膜。硬脂酸聚烃氧（40）酯是一种常用的水溶性基质，因其不溶于十四烷酸异丙酯，故不适用十四烷酸异丙酯溶解供试品、pH=7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液萃取分层的 《中国药典》方法制备供试品溶液。

吐温-80是一种亲水性的表面活性剂，具有增溶和乳化的作用。用含1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作溶剂制备供试品溶液，能提高供试品的溶解性，降低黏稠度，使供试品溶液分散均匀；用含0.1%吐温-80的pH=7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作冲洗液，可减小膜压力，增加滤过流畅性，缩短操作时间[5]。

利用硫酸锰能与喹诺酮类药物形成稳定的六元环络合物，掩盖它的活性基团的特征，消除细菌计数中喹诺酮类药物的抑菌性和膜吸附性，可有效减少冲洗液的用量，简化操作[4]。

稀释剂和冲洗剂应保温45℃，可增加供试品溶液的均一性和流动性，保证取样量准确，同时使滤过容易。

细菌测定时，若培养后培养基透明度差而不利计数，可在100 ml营养琼脂培养基中加入0.1%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）1 ml（含 0.001%的 TTC），利用细菌的琥珀酸脱氢酶在其生长繁殖过程中的活化作用，使无色的TTC还原为红色物质，使培养基变红，易于辨认计数[6]。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.北京:化学工业出版社,2005:附录 93-101.

[2]易大为，陈野，潘强.薄膜过滤法在局部给药制剂微生物限度检查中的应用[J].中国药事,2008,22(4):342-345.

[3]叶兴法,杜燕燕,胡江英.风痛灵微生物限度检查方法的验证[J].西北药学杂志,2009,24(2):140-141.

[4]张光华,余立,刘文杰.硫酸锰在几种喹诺酮类药物无菌检查中的应用[J].中国药品标准,2008,9(1):35-38.

[5]刘文杰,江志杰,余立,等.吡咯类抗真菌药物制剂微生物限度检查方法的研究[J].中国医药导报,2008,5(29):28-30.

[6]叶超,钱维清.2,3,5-三苯基氯化四氮唑浓度对细菌菌落计数影响的验证[J].中国药品标准,2007,8(1):66-69.

[7]林冬杰.中药退黄外洗液中大黄酸的含量测定[J].中国当代医药,2009,16(4):42-43.