黑龙江汉族人群肌型肌酸激酶基因CKMM- NcoⅠ多态研究

周文婷，李丽文，刘向宇

（1.哈尔滨体育学院 运动人体科学系，黑龙江 哈尔滨 150008；2.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030）

黑龙江汉族人群肌型肌酸激酶基因CKMM- NcoⅠ多态研究

周文婷1，李丽文2，刘向宇2

（1.哈尔滨体育学院 运动人体科学系，黑龙江 哈尔滨 150008；2.东北农业大学，黑龙江 哈尔滨 150030）

目的：研究黑龙江汉族群体CKMM基因NcoⅠ位点的遗传多态性分布。方法：应用PCRRFLP法测定120名黑龙江籍汉族健康大学生CKMM基因NcoⅠ位点的基因型和等位基因的频率分布。结果：等位基因频率是A=87%, G=13%，基因型频率为A/A=76% , A/G=22% , G/G=2%，经卡方检验符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，其基因型频率和等位基因频率在男女间无显著性差异，与欧美人群相比有非常显著性差异，而与我国北方汉族人及韩国人相比没有差异不显著性。

肌型肌酸激酶基因；聚合酶链式反应；限制性片段长度多态

Abstract: Objectives: To study the distribution of genotype and allele frequencies of CKMM gene at NcoⅠloci in Han origin population in Heilongjiang province. Methods: PCR-RFLP was used to determine the genotypes and alleles frequencies of CKMM gene at NcoⅠloci in 120 unrelated healthy university students. Results: The allele frequencies were: A = 87%, G = 13%. The genotype frequencies were A /A = 76%, A /G = 22%, G/G = 2% and they were in Hardy-Weinberg equilibrium. No significant difference was detected in genotype and allele frequencies between men and women. There were significant differences between Han origin population in Heilongjiang province and those in Europe and America, but no significant difference was found between Heilongjiang population and Chinese population, as well as Korean population.

Key words: CKMM gene; PCR; RFLP

CLC number: G804.2 Document code: A Article ID: 1008-2808(2010)06-0001-04

肌酸激酶（CK）通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩和ATP再生有直接关系的重要激酶［1,2］，它可逆地催化肌酸（Cr）与ATP之间的转磷酰基反应，是该反应的关键酶。CK与磷酸肌酸（PCr）组成肌酸-磷酸肌酸穿梭系统，可作为细胞内“暂时的能量缓冲系统”，用以在高能量需求时维持细胞内的ATP/ADP比率［3］；同时作为能量转运单位, 该系统也作用于将能量从产生部位转运至利用部位。CK有四种同工酶形式，分别为肌肉型(MM)、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)，其中CKMM主要表达于骨骼肌中，在心肌中也有少量表达。研究证实，肌肉中的CKMM主要集中在M线附近［4］，主要功能是在肌球蛋白头部生成高浓度的ATP，为肌肉收缩及运动供能。此外，CKMM在肌质网(SR)Ca2+ ATP酶的附近也有表达［5］，作用可能涉及Ca2+的再聚集［6］，进而影响肌肉的工作能力。

人的CKMM基因位于染色体的19q13.2～q13.3区域，长度约有17.5 kb，包含8个外显子和7个内含子。研究表明，在CKMM基因3′端非编码区存在可能与耐力有关的CKMM-NcoⅠ多态位点，且该位点在我国北方汉族人群中的分布与欧美人群相比具有非常显著性差异［7］，提示该位点可能与我国北方汉族人和欧美人体质及耐力素质间的显著差异有关，对于我们认识不同地区、不同种族间人群的体质和运动能力差异具有重要意义。然而，CKMM基因NcoⅠ位点多态性的关联研究后继乏力，对其适用性迄今尚无更多佐证，故本研究在已有研究的基础上对黑龙江籍汉族人的CKMM-NcoⅠ位点多态分布进行探索，旨在为进一步开展群体遗传学和体育科学研究提供有益的资料。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

健康大学生120例，其中男性82人，女性38人，所有研究对象均为黑龙江籍汉族，彼此无血缘关系受试者基本情况见表1。

表1 受试者基本情况

1.2 实验方法

取静脉血2mL, 2%EDTA抗凝，分离白细胞，-20℃保存。采用Promega公司试剂盒提取基因组DNA。PCR-RFLP法解析NcoⅠ位点基因型，PCR扩增引物序列如下：

F: GGGATGCTCAGACTCACAGA；R: AACTTGAATTTAGCCCAACG

PCR反 应 体 系 为：PCR反 应buffer 2μL，1.5 mmol/L MgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μmol/L，上、下引物各0.5μmol/L，Taq酶1U，模板100 ng，无菌水补足至20μL。

PCR反应参数为：94 ℃预变性7 min，94 ℃变性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。取5μL扩增产物在2%琼脂糖中进行电泳，90 V 40 min检验扩增效果。

取PCR扩增产物7 μL、限制性内切酶N coⅠ1μL ( 8 U)、10×缓冲液2 μL和0.1% BSA 2 μL于37 ℃酶切8 h。酶切产物以3%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统紫外光成像。

1.3 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学分析。以χ2检验计算基因型频率是否符合Hardy- Weinberg遗传平衡定律。采用r ×c列联表卡方检验计算与其他人群的基因型分布差异。检验显著性水平定为P＜0. 05，非常显著性差异定为P＜0. 01。

2 结果与分析

CKMM基因经PCR及N coⅠ内切酶消化以后得到3种条带：有酶切位点的纯合型有153 bp /206 bp 两条带，没有酶切位点的纯合型只有359 bp 1条带，而杂合型有153 bp /206 bp + 359 bp 3条带，其中153 bp + 206 bp /153 bp + 206 bp 是A/A纯合型，359 bp /359 bp是G/G纯合型，153 bp + 206 bp/359 bp是A/ G杂合型。

3种基因型分布经卡方检验符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P＜0. 05)，具有群体代表性。不同性别受试者在NcoⅠ位点的基因型和等位基因分布频率均无显著性差异，与周多奇等［7］研究结果相似，表明黑龙江籍汉族人在该位点与所涉地域更广的我国北方汉族人多态分布相近，具有典型的北方汉族群体遗传特征，具体分布见表2。

表2 黑龙江地区汉族人群CKMM 基因N coⅠ位点多态性分布

与加拿大、西班牙和意大利人群相比，黑龙江及我国北方汉族人在该位点的等位基因频率和基因型频率与他们均有非常显著性差异( P＜0. 01)，而与韩国人相比，基因型频率和等位基因频率差异均不显著。在对其他种族间数据进行比较后发现，韩国人与各欧美人群在等位基因频率和基因型频率上均呈显著性差异( P＜0.05)，而欧美各国人群组间则均无显著性差异（表3）。

表3 不同种族人群CKMM 基因N coⅠ位点多态性分布

个体间体质和运动能力的差异受多种因素影响，其中环境（运动训练、营养与技术方法）和遗传因素在很大程度上起决定作用，而在相同的环境下，不同的遗传背景可能是影响个体间不同体质、不同运动能力的主要原因。受制于伦理学，体质与运动能力的遗传学研究较长时期内未能广泛开展。随着生物技术与分子遗传学的发展，迄今已有包括214个常染色体基因位点、7个X染色体位点和18个mtDNA序列多态性位点在内的，与人类体质和优秀运动能力有关的基因位点被发现和定位［14］，其中有关耐力素质的研究较多，极大丰富了人们对不同种族、不同地域人群体质和运动能力差异性原因和机制的认识，也更好地促进了群体遗传学的发展。作为运动能力的重要组成部分，耐力素质是多基因控制的复杂表型。有人研究了多个代谢基因对耐力运动员体型、慢肌纤维比例及最大氧消耗量的综合作用，发现了10个与耐力相关的基因多态型，而这些基因多态型在运动员中表达的数量越多，运动员的慢肌纤维比例越高，氧消耗量越大，耐力素质也越好［15］。随着高通量SNP分析技术的应用，更快更方便的全基因组测序技术的发展，基因间的微小、多重、积累的相互作用将被检测，“运动基因”的探寻进程有望加快，通过分子技术进行优秀运动员选材的愿望将更快实现［16］。CKMM基因N coⅠ多态性是已报道的可能与耐力运动能力和耐力训练敏感性相关的多态位点，其中杂合型A/G携带者被认为可能具有更高的耐力水平和更高的训练敏感性［7-11］，周多奇等［7］对我国北方汉族人耐力训练敏感性的研究也对此也予以了证实。本研究发现，黑龙江籍汉族人中A/G基因型的频率为22%，与我国北方汉族人（24%）中该基因型频率相似，与韩国人（31%）相比差异也不显著（P＞0.05），但与欧美各国人相比，其分布频率非常显著低于各国（35%～54%）（P＜0.01）；而在韩国人中，其分布频率也显著低于欧美各国（P＜0.05），而欧美各国人间其分布频率无显著性差异（P＞0.05），表明CKMM基因N coⅠ多态性可能存在种族及地域上的显著差异，而这或许正是亚洲地区与欧美地区人群间存在较大体质和耐力水平差异的原因之一。当然，由于实验设计及研究样本量所限，很多研究都可能出现结论的相悖，然而随着后基因组计划及群体遗传学的的深入开展，相信大量的遗传学信息将会逐渐弥补这些缺憾，而本研究也将在未来进一步加大样本含量，以期更准确地描述该基因多态位点的分布特征。

3 结 论

研究首次对黑龙江籍汉族人在CKMM基因NcoⅠ位点的多态分布进行了检测，结果发现，等位基因频率分别为A=87%和G=13%，基因型频率分别为A/A=76%、A/G=22%和G/G=2%，基因型和等位基因频率在男性和女性间无显著性差异（P＞0.05），与欧美人群相比频率差异具有非常显著性（P＜0.01），而与我国北方汉族人及韩国人相比差异无显著性（P＜0.05），不仅对我国北方汉族人在CKMM基因N coⅠ位点的多态分布信息进一步予以补充，也为后续更佳深入的群体遗传学研究和运动能力的分子生物学研究提供了有用的资料。

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Research on Polymorphism in Muscle-speci fi c Creatine Kinase Gene at Nco☒loci in Han Origin Population in Heilongjiang Province

ZHOU Wen-ting1, LI Li-wen2, LIU Xiang-yu2
(1. Sports Science of Human Body Dept. in Harbin Institute of P.E., Harbin 150008, Heilongjiang China; 2. Northeast Agriculture University, Harbin 150030, Heilongjiang China)

G804.2

A

1008-2808(2010)06-0001-04

2010-09-10；

2010-12-09

黑龙江省教育厅科学技术研究项目（项目编号：11531253）。

周文婷（1979－），女，讲师，博士后，研究方向为运动分子生物学及低氧训练。