Defensin抗菌肽的序列特性分析

孙雁霞,邬晓勇,何 钢,宋 芹,王跃华

(成都大学药用微生物资源重点实验室,四川成都 610106)

Defensin抗菌肽的序列特性分析

孙雁霞,邬晓勇,何 钢,宋 芹,王跃华

(成都大学药用微生物资源重点实验室,四川成都 610106)

对defensin抗菌肽进行了生物信息学分析.一级结构表明其具有典型的昆虫防御素特征.二级结构分析表明defensin抗菌肽中主要的结构元件为α-螺旋,但有例外.信号肽及导肽分析结果显示defensin抗菌肽均属于分泌型蛋白.通过对不同物种defensin抗菌肽的分析结果表明,非阳离子抗菌肽的作用机制可能是疏水作用力起主导作用或者是对细菌胞内酶结构与功能、对细菌胞内信号转导的影响有关.

defensin类抗菌肽;序列特性;作用机制

0 引 言

defensin抗菌肽是昆虫抗菌肽的代表,属于昆虫防御素类.其典型的特征是具有6个半胱氨酸残基组成的3个分子内二硫键.它们的作用机制主要是通过在细胞膜上形成通道,引起细胞离子通透性的失衡和胞内物质的泄露,进而导致细胞活动的异常[1].由于其具有分子量小、热稳定性强、水溶性好、无免疫原性、抗菌谱广、强碱性等特点,是构成其自身免疫体系的重要组分,能非特异性地抗细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体,对肿瘤细胞、多重耐药菌也有明显的杀伤作用,且对正常生物体细胞无害,作用的机理非常独特[1,2],不易引起微生物的耐药性,是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物.

与传统抗生素相比,昆虫抗菌肽的抗菌活性还不够理想[3,4],改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是创造高活力抗菌肽的有效途径[5,6].这就需要进一步研究抗菌肽结构与活性的关系和作用机理,为抗菌肽分子的改造和设计提供足够的理论依据.本文拟对家蝇defensin抗菌肽通过生物信息学手段进行分析,以为下一步抗菌肽分子的改造和设计提供基本的理论依据.

1 材料与方法

1.1 defensin抗菌肽序列的获得

以家蝇 defensin序列 (GenBank登录号：AY260152.1)为模板在NCBI中搜索相似序列获得不同种类的defensin抗菌肽的序列,其如表1所示.

表1 不同种类defensin抗菌肽的一级结构分析

1.2 研究方法

defensin基因及其编码的蛋白的一级结构用Proparam预测,导肽预测使用T arget P1.1 Server;信号肽预测使用SignalIP工具,二级结构采用 TMHMM2. 0SERVER分析,保守结构域分析采用NCBI链接的CDD分析,三维立体结构采用Cn-3D软件分析等.

2 结果与分析

2.1 defensin抗菌肽的一级结构分析

由表1中数据可以看出,昆虫的defensin抗菌肽都是由常见的20种氨基酸组成,都不含有O、U、B、Z、X这5种氨基酸,个别还不含有色氨酸(W),一般均含有7个左右的半胱氨酸(Cys)残基,可形成3个及以上的分子内二硫键.电荷数分析表明,不同来源的defensin抗菌肽的电荷数也不相同,即出现了不带电或带负电荷的defensin抗菌肽.

2.2 defensin抗菌肽的二级结构分析

分析表明,蛋白质的二级结构为多肽链本身的折叠和盘绕(见表2).

表2 不同种类defensin抗菌肽的二级结构分析

由表2的结果可知,多数defensin抗菌肽中,α-螺旋是其主要构成元件,少数如烟草天蛾的主要构成元件则是无规则卷曲.

2.3 defensin抗菌肽的信号肽及导肽的分析

通常,分泌蛋白及细胞膜蛋白均以前体物质多肽的形式合成,其N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列,这种氨基酸序列被称为信号肽或信号序列.对蛋白的信号肽及导肽进行预测可正确认识蛋白质的亚细胞定位和其作用.用Signal IP和target P分析表明(见表3),defensin抗菌肽均属于信号肽序列,且信号肽的剪切位点均位于25左右,符合信号肽的概念.

表3 defensin抗菌肽的导肽及信号肽预测结果

2.4 defensin抗菌肽跨膜结构的预测

跨膜结构域是膜中蛋白与膜脂结合的主要部位,一般由20个左右的疏水氨基酸残基组成,形成α-螺旋与膜脂相结合.预测和分析跨膜结构域,对认识蛋白质的结构、功能、分类以及在细胞中的作用部位均有一定的意义.用TMHMM 2.0 SERVER预测跨膜结构的结果表明,家蝇(见图1)及其他物种的defensin抗菌肽均不跨膜.

图1 家蝇defensin抗菌肽跨膜结构的预测

2.5 defensin抗菌肽的保守结构域分析

蛋白质由多个模体组成,组成这些模体的氨基酸区段行使特异的功能,同时还蕴含着各自的遗传进化信息.利用NCBI链接的CDD分析家蝇及其他物种的defensin抗菌肽序列的保守结构域,得到了一致的结果(见图2),属于Defensin-2 superfamily家族.

图2 家蝇defensin抗菌肽序列的保守结构域

2.6 defensin抗菌肽的三维结构

defensin抗菌肽的三维结构如图3所示.

图3 家蝇defensin抗菌肽的三维结构图

从图3中可看出,家蝇及其他物种的defensin抗菌肽中α-螺旋是其最主要的结构元件,并且在其N-端和C-端均有大量的α-螺旋(其余图未显示).

3 讨论与结论

抗菌肽一直被认为带有正电荷,并与带负电荷的微生物细胞膜相互作用从而发挥抗菌功能.然而,从defensin抗菌肽的一级结构中发现,果蝇和埃及伊蚊不带电,而厩鳌蝇、家蚕和烟草天蛾甚至带的是负电荷.果蝇和埃及伊蚊虽然不带电荷,但是显疏水性.据此推测：既然没有正负电荷间的相互作用力,所以疏水性作用力起主要作用,即疏水作用力使此抗菌肽与细菌细胞膜靠近接触,从而发挥作用.

厩鳌蝇、家蚕的defensin抗菌肽虽然带的是负电荷,然而疏水性相对数值比果蝇和埃及伊蚊大,尤其是负电荷带的越多其疏水性数值越大,由此可以推测：此两种昆虫defensin的疏水性作用力大于负电荷间的相互排斥力,故同样可以是蛋白和细菌细胞膜接触结合.

烟草天蛾defensin,不仅带负电荷,而且是亲水性蛋白.信号肽分析结果表明,其N端有信号肽链,发挥作用时,信号肽引导其至作用位点,然后在其肽链第29～30(SVA-FE)氨基酸之间断裂.分析其二级结构表明,其主要构成元件是无规则卷曲,这类有序的非重复性结构经常构成酶活性部位及蛋白质特异的功能部位,故推测其可能为酶类,作用于细胞膜表面的膜蛋白.经过protfun 2.2serve蛋白功能分析,结果显示其是一个参与运输及信号转导的酶类蛋白,而此类抗菌肽的作用机制很可能与抗菌肽对细菌胞内酶结构与功能对细菌胞内信号转导的影响有关.

[1]王义鹏,赖 仞.昆虫抗菌肽结构、性质和基因调控[J].动物学研究,2010,31(1)：27-34.

[2]蔡 禄.生物信息学教程[M].北京：化学工业出版社, 2007.

[3]吴 希,张双全.抗菌肽对细菌杀伤作用的分子机制[J].生物化学与生物物理进展,2005,32(12)：1109-1113.

[4]卢晓风,杨星勇.昆虫抗菌肽及其研究进展[J].药学学报,1999,34(2)：673-678.

[5]耿 华,安春菊,郝友进,等.昆虫抗菌肽的结构和功能研究现状[J].生物学通报,2004,39(10)：1-4.

[6]王学理,王兴龙,刘 锴,等.抗菌肽的作用机制与应用前景[J].动物医学进展,2006,27(9)：42-45.

Sequence Characteristic Analysis of Defensin Antimicrobial Peptides

SUN Yanxia,WU Xiaoyong,HE Gang,SONG Qin,WANG Yuehua

(Key Laboratory of Medical Microbial Resources,Chengdu University,Chengdu 610106,China)

Defensin antimicrobial peptides were analyzed by bioinformatics tools.Primary structure shows that the defensin has typical characteristics of insect defense.Secondary structure analysis shows that the main defensin antimicrobial peptides are alpha helix structure components,but there is an exception.The signal and target peptide analysis shows that defensin antimicrobial peptides belong to secrete protein.After the analysis of different species of defensin antimicrobial peptides,the results show that the mechanism of non-cation antimicrobial peptides is that hydrophobic force plays a leading role or antimicrobial peptides influence the structure and function of enzymes and signal transduction in bacteria cell.

defensin antimicrobial peptides;sequence characteristics;mechanism

Q74

：A

1004-5422(2010)02-0101-03

2009-12-25.

成都大学科技基金资助项目.

孙雁霞(1976—),女,博士研究生,讲师,从事生物技术研究.