耐酸乳酸菌的筛选及初步鉴定

苟兴华,王艳文,李 翔,刘达玉,王 卫

(1.成都大学生物产业学院,四川成都 610106;2.肉类加工四川省重点实验室,四川成都 610106)

耐酸乳酸菌的筛选及初步鉴定

苟兴华1,2,王艳文1,李 翔1,2,刘达玉1,2,王 卫2

(1.成都大学生物产业学院,四川成都 610106;2.肉类加工四川省重点实验室,四川成都 610106)

以自然发酵泡菜汁液为菌源,以不同的pH值作为对照,并利用不同的pH值作为筛选的初步条件,对耐酸乳酸菌进行筛选,然后对筛选出的菌株做定性实验,包括：产生溶钙圈,革兰氏染色阳性,以及接触酶反应呈阴性.在本实验条件下初步筛选出耐酸性强的2株菌株：菌株2,菌株3,同时,对分离出的乳酸菌菌株划线于MRS固体斜面培养基上,于4℃下保存,为进一步研究奠定了良好的基础.

耐酸乳酸菌;筛选;初步鉴定

0 引 言

凡能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌.大量的科研结果表明,以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌,其数量的多少,直接影响到人们的健康及寿命长短[1].研究表明,大部分乳酸菌在通过人体消化道到达肠道之前,因不能耐受胃液酸度而死亡,而仅有少数乳酸菌能耐酸,此类耐酸性乳酸菌能在人体中更有效地发挥保健作用,因此具有很大的开发价值[2,3].

嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)是人类和动物肠道内有益微生物之一,其可以阻止病原微生物对肠道的入侵和定植,抑制病原菌和抗感染,维持肠道的微生态平衡,预防和抑制肿瘤的发生,增强机体免疫力,促进消化,降低胆固醇,抑制内毒素的发生,延缓机体衰老和抗辐射等.嗜酸乳酸菌在肠道中的数量与宿主的健康状况有着密切的关系,这已引起了人们的特别关注.嗜酸乳杆菌产生的具有抑菌活性的代谢产物细菌素,不仅可以改善肠道的微生态,而且是一类具有潜在开发价值的天然食品防腐剂和饲料添加剂.目前,耐酸乳酸菌已被广泛应用于食品、医药以及工业等领域.本研究的主要目的是初步筛选出可以预期作为调节肠道菌群平衡的微生态制剂菌株,为今后的应用及研究打下基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 菌株来源.

以自然发酵泡菜作为筛选菌株的主要来源.

1.1.2 培养基.

MRS选择培养基：蛋白胨 10 g、牛肉提取物10 g、酵母提取物5 g、葡萄糖20 g、无水乙酸钠5 g、吐温-80 1 mL、柠檬酸二胺2 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g(固体培养基中加琼脂约15 g、3%碳酸钙)、蒸馏水1 000 m L,pH值为6.2～6.8.

1.1.3 试 剂.

实验所用试剂包括：正丁醇,甲酸,乙酸,乳酸, 3%溴甲酚蓝酒精溶液,3%过氧化氢等,均为分析纯.

1.1.4 仪 器.

实验所用仪器包括：手提式不锈钢蒸汽消毒器, LRH系列生化培养箱,无菌操作台,FA(N)/JA(N)系列电子天平.

1.2 实验方法

1.2.1 耐酸乳酸菌的初步分离.

取自然发酵泡菜汁液1 mL以10倍递增稀释方法(1份泡菜汁,9份无菌水,再取1份第1支管中溶液,加9份无菌水,依次类推)将其稀释,然后分别取第4～6支试管稀释液1 mL,倾注于pH值为3.5和pH为3.0的MRS液体培养基上,放置于30℃恒温培养箱中培养48 h.

1.2.2 耐酸乳酸菌初步分离后的纯化.

用接种环以无菌操作方式挑取自然发酵泡菜稀释液,将挑取有样品的接种环在MRS固体培养基上做连续划线,划线完毕后,盖上培养皿盖,倒置于温室中培养.

1.2.3 耐酸乳酸菌的进一步分离.

分别取第4～6支试管稀释液1 mL,倾注于pH值为3.3的MRS液体培养基上,放置于30℃恒温培养箱里培养48 h.

1.2.4 耐酸乳酸菌的进一步纯化.

耐酸乳酸菌的进一步纯化步骤按1.2.2项下步骤进行.

1.2.5 细胞染色及形态鉴定.

在菌落形态方面,观察分离培养基平板上菌落的形态(形状、色泽、大小等);在细胞形态方面,将所分离的菌株进行革兰氏染色,在显微镜下观察菌体形态.

1.2.6 过氧化氢酶(接触酶)反应.

将3%的过氧化氢滴于涂有菌苔的载玻片上,静置1～3 min,观察是否有气泡产生.

1.2.7 产乳酸定性分析实验.

本实验采用乳酸纸层析法做产乳酸定性分析,具体方法如下：

(1)层析滤纸的制备.将层析滤纸剪成1.5 cm× 11 cm的长条状,在距层析纸一端约4 cm处用铅笔划线确定点样线,使用前充分干燥.

(2)配制展开剂.正丁醇∶甲酸∶水为80∶15∶5. (3)配制标准液.配制1.5%的乳酸溶液.

(4)制备待测样品.将菌种37℃培养24 h后离心,收集上清液

(5)点样.用毛细管分别吸取发酵液,多次点样于滤纸条上,样点直径不宜超过2 mm,平衡2 h.

(6)层析.将点好样的层析纸放入,使点有样品的一端浸在展开剂中,但不可浸及样点.观察展开情况,待展开剂前沿到达离层析纸另一端约1.5 cm处,取出层析纸.

(7)显色.以3%溴甲酚蓝酒精溶液为显色剂,待层析液挥发之后,向层析滤纸喷洒并计算 Rf值.

1.2.8 菌种保存.

目标菌株纯化后,划线于MRS固体斜面培养基上,于4℃下保存.

2 结果与分析

2.1 耐酸乳酸菌初步分离纯化后结果

耐酸乳酸菌在pH值分别为3.5与3.0的液体MRS液体培养基上经初步分离后,在MRS固体培养基上划线纯化.在pH值为3.5的液体培养基中生长的菌株接种到固体培养基上时,形成溶钙圈的菌落众多,排列紧密,且长势良好;在pH值为3.0的液体培养基上生长的菌株接种到固体培养基上时,无明显菌落形成,更无产生溶钙圈的菌落产生.

2.2 耐酸乳酸菌进一步分离纯化后结果

在pH值为3.3的MRS液体培养基上分离的菌株接种到固体培养基上纯化培养后,在固体培养基上形成的溶钙圈明显,约1～3 mm,圆形隆起,表面光滑或稍粗糙,呈乳白色、灰白色或暗黄色,形态良好的菌落若干个.即在介于pH值为3.5和3.0之间pH值为3.3的条件下,分离得到了相对耐酸性较强的菌株.

2.3 细胞染色与形态鉴定结果

随机挑取3个菌落的细胞进行染色和形态鉴定：3个菌落的细胞均呈多样形杆状(长或细长杆状,弯曲形短杆状及棒形球杆状),呈链状排列.同时,革兰氏染色呈阳性.

2.4 过氧化氢(接触酶)反应实验结果

将3%的过氧化氢滴于涂有菌苔的载玻片上,静置1～3 min,菌落1有气泡产生,菌落2和3无气泡产生.

接触酶又称为过氧化氢酶,是一种以正铁血红素作为辅基的酶,能将过氧化氢分解为水和氧.一般好氧细菌与兼性厌氧细菌(除某些链球菌、乳酸杆菌等外)都能产生接触酶,而厌氧细菌不产生接触酶,不发生过氧化氢反应.本实验结果表明：菌落1的细菌为好氧细菌或是兼性厌氧细菌;而菌落2和3的细菌为厌氧细菌.

2.5 产乳酸定性分析实验结果

采用纸层析法测试乳酸喷显色剂后显色情况,实验结果如图1所示.

Rf1=19/25=0.76,Rf2=18.8/25=0.752,Rf3=18.9/25=0.756图1 产乳酸定性分析结果

结果分析显示：喷显色剂后菌落2和3都出现黄色斑点,与2%乳酸对照相比,位置基本相同,证明有乳酸的存在,表明2种菌都产乳酸.

3 结 论

本文以自然发酵泡菜汁液为菌源,以pH值作为对照,首先利用不同的pH值作为筛选的初步条件,进行了耐酸乳酸菌的筛选,然后对筛选出的菌株做定性实验,包括产生溶钙圈,革兰氏染色阳性,以及接触酶反应呈阴性,从而初步筛选出在本实验条件下耐酸性强的2株菌株：菌株2,菌株3,分离出的乳酸菌菌株已经划线于MRS固体斜面培养基上,于4℃下保存.

在下一步的研究中,我们拟进一步进行乳酸菌的定性分析实验,同时对其16s RNA进行测序分析.需要说明的是,如何在发酵以及其他领域应用好这些菌株来强化发酵食品以及其他制品的保健功能性,提高农副产品的附加值是今后科研工作的重点和难点.

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Preliminary Identification and Screening of Acid-resisting Lactic Acid Bacteria

GOU Xinghua1,2,WANG Yanwen1,LI Xiang1,2,LIU Dayu1,2,WANG Wei2

(1.School of Bioindustry,Chengdu University,Chengdu 610106,China; 2.Key Meat Processing Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610106,China)

Taking the natural fermentation of kimchi as germ origin,different PH values as comparing aspects as well as preliminary screening conditions,acid-resisting lactic acid bacteria was screened and the screened strains were used to do qualitative experiments,which consisted of generating circle of calcium dissolved,the results of Gram stain test and catalyzing reaction were positive and negative respectively.Finally,two acid-proof strains,namely Strain 2 and Strain 3 were obtained in this experiment.In order to do the following study,the two kinds of lactic acid bacteria have been crossed on MRS solid slope medium and preserved at the temperature of 4℃.

acid-proof lactic acid bacteria;screen;preliminary identification

Q935

：A

1004-5422(2010)02-0095-03

2009-12-15.

苟兴华(1963—),男,博士,副教授,从事食品生物技术研究.

文章编号：1004-5422(2010)02-0120-04