苦瓜种子蛋白的抗菌实验

魏 决,罗 雯

(成都大学生物产业学院,四川成都 610106)

苦瓜种子蛋白的抗菌实验

魏 决,罗 雯

(成都大学生物产业学院,四川成都 610106)

采用碱提法提取苦瓜种子中的蛋白质,抗菌实验结果表明：苦瓜种子蛋白对大肠杆菌、根霉菌和酿酒酵母菌都有明显的抑菌作用,而对根霉菌作用最明显,此表明苦瓜种子有较高的药用保健价值.

苦瓜蛋白;大肠杆菌;根霉菌;酿酒酵母菌;抑菌作用

0 引 言

苦瓜为葫芦科一年生攀援草本苦瓜属植物的果实,具有瓜类食品特性,是常用蔬菜之一.苦瓜果实虽性寒味苦,却富含营养和药用成分,具有清火明目、解毒、降低血糖等多种功效,常用于中暑、痢疾、赤眼疼痛、痈肿丹毒、恶疮等症的治疗.目前,国内外学者从苦瓜的果实和种子中分离出许多水溶性蛋白质和萜皂苷等成分,研究表明,其具有降血糖、抗生育、抗肿瘤及免疫抑制活性等作用[1-4].此外,苦瓜汁具有免疫调节、抗菌和治疗小儿痢疾等作用.

目前,人们对苦瓜种子的相关研究不多,而苦瓜种子蛋白含量高,蛋白质组分复杂,有其独特的药理作用[5,6].因此,本文拟通过研究苦瓜种子蛋白对大肠杆菌、酿酒酵母菌和根霉菌的抑制效果,并与化学合成防腐剂的防腐作用对比,以期对苦瓜种子蛋白作为一种天然的抗菌防腐剂的研究进行有益探索.

1 材料、仪器与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验材料.

实验所用苦瓜籽购于成都市蔬菜种子站.大肠杆菌、酿酒酵母菌和根霉菌由成都大学微生物实验室提供.

1.1.2 试 剂.

实验所用试剂包括：硫酸铜,浓硫酸,磷酸氢二钠,磷酸二氢钾,氯化钠,硫酸铵,盐酸,考马斯亮蓝试剂,氢氧化钠,M.H琼脂,麦芽糖培养基,察氏培养基.

1.2 仪 器

实验所用仪器包括：恒温水浴锅,高速离心机,紫外分光光度计,电热恒温干燥箱,分析天平,托盘天平,电热恒温培养箱,手提式压力蒸汽灭菌锅等.

1.3 方 法

1.3.1 苦瓜籽的处理.

选择大小一致的苦瓜籽,用食品粉碎机粉碎苦瓜籽壳后,选出壳内的苦瓜种子,再用食品粉碎机将其粉碎成细粉,将粉碎后的细粉平铺风干后,置于干燥的地方保存.

1.3.2 配制pH值为8.04的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液.

称取11.876 g磷酸氢二钠,9.078 g磷酸二氢钾分别置于2个小烧杯中,加入纯净水,待其溶解后分别将其倒入2个1 000 mL的容量瓶中,将小烧杯清洗几次,并分别把清洗液倒入容量瓶,分别定容至1 000 mL,容量瓶摇匀.取95 mL磷酸氢二钠溶液和5 mL磷酸二氢钾溶液倒入小烧杯中并摇匀,配制成pH值为8.04的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液. 1.3.3 磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液提取苦瓜种子中的蛋白质.

称取10 g苦瓜种子细粉于磨口三角瓶中,取配制好的磷酸氢二钠—磷酸二氢钾缓冲液100 mL倒入磨口三角瓶中,摇匀后放入4℃的冰箱中提取12 h.

将磨口三角瓶从冰箱中取出,立即用真空循环泵抽滤,取上清液,将抽滤后的液体装入小烧杯中,记录液体的体积,同时,上清液加入饱和度硫酸铵, 4℃环境下搅拌沉淀3 h后,取上面的蛋白质溶液,弃去下面的沉淀.在常温下将溶液在转速4 000 r/min下离心20 min后取出,去除上清液,将蛋白质用药匙刮出后放入另一个小烧杯,并加少量纯净水使其溶解.

1.3.4 苦瓜种子蛋白定性试验.

苦瓜种子蛋白的定性实验采用双缩脲法.取一支试管加入1 mL苦瓜种子蛋白液,再加入5滴10%的NaOH溶液,摇匀后,继续加入1滴1%的CuSO4溶液,若出现紫红色现象则表明有蛋白质存在.

1.3.5 苦瓜种子蛋白含量测定.

苦瓜种子的蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定.

1.3.6 绘制标准曲线.

考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1 000 mL,滤纸过滤.

标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用0.15 mol/L Nacl配制成1 mg/mL,0.1 mg/mL的蛋白溶液.

在分光光度计上于波长595 nm处绘制标准曲线.

1.3.7 样品的定量.

实验采用以上同样的操作方法对提取的蛋白质样品稀释50倍后进行定量.

1.3.8 培养基的制备.

培养基的制备包括：

(1)牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.5 g,蛋白胨1 g,Nacl 0.5 g,蒸馏水1 000 mL,pH值为7.2.将培养基分装入250 mL锥形瓶中,每个锥形瓶装25 mL,用纱布加橡皮筋包扎.

(2)麦芽糖液体培养基：蛋白胨 10 g,麦芽糖20 g,酵母酶淀粉5 g,蒸馏水1 000 mL,自然pH值.操作方法方法同上.

(3)察氏液体培养基：蔗糖 3 g,NaNO30.3 g, K2HPO40.1 g,KCl 0.05 g,MgSO47H2O 0.05 g,EDTA少量,蒸馏水1 000 mL,自然pH值.操作方法同上.

(4)菌层培养基的配制同液体培养基配制的方法相同,在定容之后加入0.7%的琼脂,电炉上加热充分溶化后,加棉塞.

(5)底层培养基的配制同液体培养基配制,并加入少量的C源、N源等营养物质,在定容之后加入1.5%的琼脂,在电炉上加热充分溶化后,加棉塞.

(6)灭菌处理.将以上液体培养基、菌层培养基、底层培养基和接种所需的器皿,经包扎后放入灭菌锅灭菌.

(7)菌液的制备：①菌种活化.在接种室内,用接种环挑起一小环放入相应的液体培养基中,将液体培养基瓶口灭菌塞好.28℃震荡培养,根据菌种的不同培养时间不同,大肠杆菌6～7 h,酿酒酵母菌和根霉菌72 h.②菌液培养基的制备.将菌层培养基溶化到50℃,然后将经活化后的菌倒入其中,震荡均匀.

1.4 抑菌试验

1.4.1 抗生素溶液的制备.

取阿莫西林胶囊5个,将其中的粉末倒出用蒸馏水溶解,放置一段时间,去除沉淀取上清液.然后于接种室中,将底层培养基溶化,15 mL分别倒入9个平板,待凝固,将每个菌种的菌层培养基5 mL分别倒入3个凝固的底层培养基上,均匀涂布,即每个菌种做3组平行实验,凝固后将灭菌的牛津杯放置在培养基上,每个平板放4个,使其与培养基接触无间隙,并在培养皿背后做上编号,然后分别在每个牛津杯中加满0.5 IU/mL抗生素、无菌水,0.2%山梨酸钾和4.6 mg/mL苦瓜籽蛋白液进行培养,其中大肠杆菌37℃、24 h,酿酒酵母菌30℃、48 h,根霉菌30℃、72 h,12 h后开始观察.最后分别测定抑菌圈直径(取平均值),并比较苦瓜种子蛋白液对各试验菌的抑菌效果.

1.4.2 最低抑菌浓度(MIC)的测定.

通过标准曲线可知苦瓜种子蛋白提取液的浓度,将提取液进行稀释,得浓度分别为4.6 mg/mL, 3.8 mg/mL,3.0 mg/mL,2.2 mg/mL,1.4 mg/mL, 0.6 mg/mL的溶液,每一系列浓度接种一种菌,同样用牛津杯法将它们加入各菌层培养基孔隙内,每个浓度做3个重复,按以上抑菌试验的步骤方法,置适宜温度下培养,观察生长情况.培养基中完全没有菌生长的最低浓度为最低抑菌浓度.

2 实验结果

2.1 苦瓜种子蛋白定性试验

苦瓜种子蛋白的定性试验采用双缩脲试验,实验发现试管溶液有紫红色现象出现,说明提取出来的物质为蛋白质.

2.2 苦瓜种子蛋白定量试验

将苦瓜种子提取液稀释50倍,测得样品稀释液OD值为0.614,根据标准曲线(见图1)得到苦瓜种子蛋白原液的浓度为4.6 mg/mL,实验中,苦瓜种子蛋白的得率为3.2 mg/g.

图1 考马斯亮蓝G-250测定牛血清蛋白标准曲线

2.3 苦瓜种子蛋白抑菌效果

苦瓜种子蛋白抑菌效果如表1所示.表1数据表明,苦瓜种子蛋白对大肠杆菌、根霉菌和酿酒酵母菌均有明显的抑制作用,说明在苦瓜种子蛋白中有对细菌和霉菌有抑制作用的蛋白成分存在.同时,由表1数据可知,其对霉菌和酵母菌的抑制效果较强,细菌次之.

表1 苦瓜种子蛋白抑菌效果

2.4 苦瓜种子蛋白最低抑菌浓度(MIC)

苦瓜种子蛋白液的最低抑菌浓度范围在3.0～3.8 mg/mL(见表2),且对真菌的抑菌浓度较低,说明苦瓜籽蛋白对真菌的抑制效果较好.

表2 苦瓜种子蛋白浓度对供试菌种抑菌效力的影响

3 讨 论

通过实验证实,苦瓜种子蛋白对细菌和真菌都有明显的抑菌作用,其中对真菌的抑制效果好于细菌.

苦瓜种子蛋白对3种实验菌最低抑菌浓度分别为：根霉菌3.0 mg/m L,酿酒酵母菌为3.0 mg/m L,大肠杆菌为3.8 mg/m L.这也显示苦瓜种子蛋白对根霉和酿酒酵母菌的抑制作用相对较强,而对细菌的抑制作用相对较弱.

目前,人们已从多种植物中发现了抗菌蛋白和抗菌肽成分[7,8],从苦瓜种子蛋白的抑菌作用可知其中含有抑制微生物生长的组分,这可作为天然食品防腐剂和抗菌消炎药物成分加以开发.关于苦瓜种子蛋白中具体的抑菌成分及抑菌机理还有待进一步试验研究.

[1]刘 霞,部德俊.苦瓜的研究进展[J].中药材,2002,25 (3)：211-213.

[2]何煜波.苦瓜抗菌作用研究[J].食品科学,1998,19(3)：34 -36.

[3]龚大春,杨雪海.苦瓜种子蛋白抑菌作用探讨[J].中兽医学杂志,2005,49(6)：8-9.

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[6]郭红莲,张泽生.苦瓜籽中营养成分及抗菌蛋白的研究[J].粮油加工与食品机械,2005,36(6)：77-78.

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Antimicrobial Experiment of Protein Contained in Balsam Pear Seed

WEI Jue,LUO Wen

(School of Bioindustry,Chengdu University,Chengdu 610106,China)

Alkali formulation was used to extract the protein contained in balsam pear seeds for doing antimicrobial experiment.The findings show that the protein contained in balsam pear seeds has a significant antimicrobial effect on E.coli,Rhizopus and Saccharomyces cerevisiae.The most obvious effect is on root fungus,which indicates the seeds have high medicinal value of health care.

balsam pear;escherichia coli;rhizopus;saccharomyces cerevisiae;antibacterial effect

S642.5;R282.71

：A

1004-5422(2010)02-0098-03

2009-12-18.

魏 决(1962—),女,副教授,从事食品加工工艺及天然有效成分提取研究.