全蝎纯化液对凝血酶诱导血管内皮细胞纤溶活性的影响1)

谭 琥,彭延古,黄 莺,徐爱良,李路丹,易小民

血管内皮细胞(vascular endothelia cells,VEC)是铺陈与血管壁内侧的一种多功能的细胞,对血栓与止血、炎症与免疫和血管新生、物质转运等多种生理病理过程具有重要的调节功能[1]。VEC在生理情况下具有强大的抗凝和抗血栓功能,但在某些病理及凝血酶、白介素-1(IL-1)和NEAV等的作用下却表达出促凝活性[2]。正常情况下,内皮细胞可分泌组织型纤溶酶原激活物(t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI),具有较强的调节纤溶的功能。t-PA可促进纤溶酶原活化,对纤溶有很强的促进作用;而PAI可对其起到抑制作用,二者构成一对平衡物质,共同维持机体纤溶功能的平衡稳定。本研究以凝血酶-血管内皮细胞建立模型为对象,研究全蝎纯化液对凝血酶诱导的VEC纤溶功能改变的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞(VEC-340)由武汉大学典型物种保存中心提供。全蝎购自湖南省医药公司,经水煮、醇沉,经凝胶沉析、离子交换沉析等分离纯化过程将其制备、冻干备用。凝血酶购自Sigma公司,RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司,小牛血清(FCS)购自杭州四季青公司;胰蛋白酶购自美国Gibco公司,CO2培养箱为美国 Sheldon Manufacturing inc公司产品,酶标仪为芬兰Labsystens集团产品,倒置显微镜为日本Olympus产品,超净工作台为苏州净化设备公司提供。t-PA、PAI检测试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 内皮细胞培养和鉴定 将VEC-340细胞株用Hank’s液清洗后以0.25%胰蛋白酶消化,用含10%FCS的RPMI 1640培养液终止反应,离心弃上清液,用 RPMI 1640培养液(10%FCS,100 kU/L青霉素,100 kU/L链霉素,pH7.2)制成7.5×104/mL细胞悬液,接种于培养板中,37℃,5%的CO2培养箱中培养,每2 d换液1次,待细胞长融合后,用于实验。实验选用经Ⅷ因子免疫荧光检测并生长良好的第2代～第3代内皮细胞。

1.2.2 实验分组 同前培养的VEC-340融合后,随机分为空白组、凝血酶(终浓度10 U/mL)组及全蝎大剂量(24 μ g/mL)、中剂量(12 μ g/mL)、小剂量(6 μ g/mL)组。空白组加入等量培养液。

1.2.3 检测指标与方法 取上述各组培养液分别检测t-PA,采用发射底物法。PAI采用发射底物法。方法参照试剂盒说明书进行检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析,数据以均数±标准差(±s)表示,采用 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

与空白组比较,凝血酶组t-PA活性降低,PAI活性增高,差异有统计学意义(P＜0.01),与凝血酶组比较,全蝎大剂量、中剂量、小剂量组t-PA活性均增高,PAI活性降低,差异均有统计学意义(P＜0.01)。详见表1。

表1 全蝎纯化液对凝血酶诱导VEC释放t-PA、PAI活性的影响(±s)

表1 全蝎纯化液对凝血酶诱导VEC释放t-PA、PAI活性的影响(±s)

组别 孔数(孔) t-PA(kU/L) PAI(kAU/L)空白组 10 0.66±0.04 0.86±0.02凝血酶组 10 0.55±0.051) 1.69±0.121)全蝎大剂量组 10 1.08±0.122) 0.63±0.012)全蝎中剂量组 10 0.89±0.062) 0.97±0.022)全蝎小剂量组 10 0.75±0.072) 1.12±0.112)与空白组比较,1)P＜0.01;与凝血酶组比较,2)P＜0.01

3 讨 论

血管内皮细胞不仅是血液与血管内皮细胞之间的生理屏障,而且是高度活跃代谢库,它既能合成和释放多种抗栓、溶栓成分,如血栓调节蛋白(TM)、t-PA、前列环素(PGI2)、内皮舒张因子(EDRF),而具有抗血小板聚集,扩张血管和促纤溶作用,又能在受到刺激或损伤时释放多种促血栓形成物质,如凝血因子、内皮素、PAI,引起血栓形成[3-6]。对组织血管血栓形成和微循环障碍有重要影响。观察 t-PA和PAI比值的变化可以评价纤溶系统的改变,并间接的反应血管内皮细胞的功能[7]。t-PA和PAI是纤溶系统一对重要调节因子,t-PA是纤溶的重要生理性刺激剂,启动生理性纤溶,消除血管床上的纤维蛋白沉积,机体通过其来消除血管内部适当的血栓形成;PAI则是t-PA的快速抑制剂[8],可由VEC合成和分泌。内皮细胞可以合成分泌多种血管活性物质,如 PAI-I、t-PA、血管性假血友病因子(vWF)、内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)等,可调节血管张力,影响凝血纤溶功能,维持血管内皮促血栓形成与抗血栓形成两种作用之间的平衡[9]。两者均可由VEC合成,t-PA活性降低,PAI活性增高,可导致血栓形成。t-PA和PAI作为反映纤溶的主要指标,同时亦反映血管内皮功能。是调节纤溶系统功能的关键物质,因此两者在血栓并发症和心血管疾病的发生发展中起重要作用。

近年来研究表明,血栓性疾病的发生与t-PA和PAI含量及活性的变化有密切关系,凝血酶能增强内皮细胞的通透性,且这种反应与内皮细胞收缩反应一致[10]。本实验观察到全蝎纯化液可明显提高凝血酶诱导血管内皮细胞t-PA的活性,降低t-PA的活性,提示全蝎纯化液抗栓、溶栓机制可能与影响VEC合成和分泌t-PA和PAI有关。由于t-PA的活性增强,PAI活性减弱,而呈现纤溶作用,可防止血栓形成,使血栓溶解。至于全蝎纯化液是通过何种途径使内皮细胞合成和分泌 t-PA和PAI发生改变,提示可能是其降低VEC的纤溶抑制物活性,从而使VEC的纤溶活性提高,对促进血栓溶解有重要意义。

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