原料乳中抗生素定性检测-发酵酸度法研究

李琴 轩诗海

（1.黑龙江省完达山乳业股份有限公司，黑龙江省 哈尔滨 150078）

牛奶，是一种非常健康和营养的食品。然而，乳牛因为疾病治疗而服用或被注射抗生素类药物其残留物会存在于牛奶中。当人类长期食用了含有抗生素残留物的牛奶，会引起一系列不良反应，尤其是一些毒副作用较大或质量低劣药物。如过敏反应、被具有抗生素耐药性的食源性病原体感染、以及致畸作用等。因此，牛奶中抗生素残留对人类健康的危害不仅是一个公共卫生和食品安全问题，也会给国家带来经济负担。

抗生素类药物广泛地应用于乳牛的各种感染性疾病，其品种繁多，例如：β-内酰胺类（青霉素、头孢菌素）；磺胺类；氨基糖甙类（链霉素、庆大霉素）；四环素类；大环内酯类（红霉素、罗红霉素）；氯霉素类；林可霉素类（林可霉素、克林霉素）；抗细菌的抗生素（磷霉素）等等。

目前国际上常用的兽药残留免疫学快速检测方法主要有传统的酶联免疫吸附法、胶体金法及SNAP双流向酶联免疫法，均存在检测种类不能全部覆盖的缺陷。

发酵酸度原理是：在经杀菌的牛乳中，添加嗜热链球菌培养，在样品中不含有抗生素情况下，嗜热链球菌将繁殖，发酵牛乳，牛乳凝固产酸，3小时内酸度可达70°T；如样品中含有抗生素，嗜热链球菌的繁殖将受到抑制，导致牛乳凝固状态不好，产酸量少，3小时内酸度无法达到70°T。从而判断牛乳中是否有抗生素残留。因嗜热链球菌对抗生素极敏感，各类抗生素对其均有抑制作用，所以发酵酸度法可有效对牛乳中抗生素残留进行初筛，达到控制有抗奶的目的。

1 材料与方法

1.1 设备和材料

1.1.1 灭菌锅：115℃±1℃

1.1.2 冰箱：0℃～4℃

1.1.3 恒温培养箱：43℃±1℃

1.1.4 显微镜：10×～100×

1.1.5 托盘药物天平：0g～500g，精确至0.5g

1.1.6 锥形瓶：1000mL、500mL、200mL、100mL

1.1.7 温度计：0℃～100℃

1.1.8 灭菌试管：16mm×160mm、18mm×180mm及相应的试管架

1.1.9 灭菌吸管：1 mL、5 mL、10 mL

1.1.10 接种灯和接种环

1.2 试剂

1.2.1 嗜热链球菌（Streptococcus Thermophilus）：

1.2.2 0.1mol/L氢氧化钠溶液。

1.2.3 脱脂乳粉：无抗生素。

1.3 制备及验证

1.3.1 菌株活力的制备

1.3.1.1 按无菌操作要求，用接种环挑取适量冻干的嗜热链球菌接种于一支或两支脱脂乳培养基试管中，摇匀后于43℃培养箱中进行培养，至凝乳结实、无乳清析出。培养过程中要及时观察并记录凝乳时间。

1.3.1.2 选取凝乳较好的一支试管，从中吸取0.2～0.3ml凝乳，再接种于两支试管中，摇匀后于43℃培养箱中培养，至凝乳结实、无乳清析出时取出继续传代，按GB/T 5409检测酸度。

1.3.1.3 当培养基在3.5-4.5小时凝固，凝乳酸度达到70oΤ时，镜检确认菌株符合嗜热链球菌形态后即可认为菌株活力完全恢复。

1.3.1.4 菌株的保存：培养至稳定的菌株可于4℃冰箱内保存备用，根据菌株自身特性进行定期传代，一般为七天一次。

1.3.2 菌株活力验证：

1.3.2.1 镜检：革兰氏染色试验，于100倍的油镜显微镜下观察菌体。

1.3.2.2 每一代均要镜检，判断菌株是否正常或变异，如变异或污染杂菌需重新更换菌株。

1.3.3 培养基的制备

准确称取120g无抗生素脱脂乳粉溶于880ml，50℃-60℃的蒸馏水中，充分溶解后分装于锥形瓶100mL、10mL试管中；用灭菌锅115℃灭菌20分钟，冷却后放置冰箱中备用。

检测用菌液的制备：将菌株活力按需要扩大培养，扩培条件与菌株活化一样，接种量为2～3%，培养温度43℃，发酵酸度达70oΤ。扩培后菌液放入冰箱中备用(放置时间不能超过一周)。

1.4 操作步骤

1.4.1 样品处理：液体样品取200ml，固体样品准确称量24克，溶于176ml，50-60℃的蒸馏水中，充分溶解后放置30分钟，然后进行水浴杀菌，杀菌条件为95℃，10分钟。

1.4.2 样品发酵：将杀菌后样品溶液冷却至45℃进行接种，接种量为3%（无菌操作），充分摇匀后放入43℃培养箱中培养。培养2小时取样检测酸度，酸度检验按GB/T 5409规定进行。

2 结果与分析

2.1 对照实验：取酶联免疫试剂盒检测为阳性的牛奶样品5个，进行发酵酸度试验，结果见表1：

2.2 添加实验：取无抗牛乳为本底样品，人为添加磺胺嘧啶，添加量分别为：5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg，进行发酵酸度试验，结果见表2：

3 结论

发酵酸度法可有效对牛乳中抗生素残留进行初筛，方法处理简单，易操作，试验成本低，分析周期短，因此该方法可作为原料奶抗生素的快速筛选检测方法。