虫草/甜菜碱复合饲料营养液的HPLC分析

翟 睿，张 品，董 婧

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，沈阳，110161； 2岛津国际贸易有限公司沈阳分公司，沈阳，110161)

1 前言

冬虫夏草是我国传统名贵中药，但由于其有极严格的寄生性和特殊的生长地理环境限制，产量相当稀少。近年来，采用生物发酵的方法进行虫草类似物的生产得到较快的发展，仅浙江一省就有多家这类生产厂家[1,2]。大多数虫草产品的生产厂商，把发酵菌丝体分离之后，占97%的发酵液作为废液仅作简单处理或直接排放掉，不仅造成环境污染，而且极大地浪费资源[3]。虫草菌发酵废液中富含虫草菌、蛋白质、氨基酸、D—甘露糖、虫草多糖等大量的有机物[4]。如将此废液作为营养液添加入饲料中，必可使饲料中营养成分大幅提升，且起到了废物再生、保护环境、节约资源的作用。

甜菜碱是从甜菜及其糖蜜中提取的一种季胺型生物碱，化学名称为三甲胺乙内酯[5]。为机体高效提供活性甲基，参与蛋白质与脂类代谢，调节渗透压，缓解应激，促进采食等生理作用[6]。可将甜菜碱与虫草菌发酵废液一同作为营养液添加入饲料中，可在提高饲料营养的同时改善摄食动物的食欲，使动物在短期内得到更多营养。

为便于从饲料中检测出这种虫草/甜菜碱复合饲料营养液，本文发展了一种同时检测二者含量的高效液相离子交换色谱分析方法。

2. 实验部分

2.1 仪器与试剂

依利特P230高效液相色谱系统(大连依利特分析仪器有限公司)：UV230+紫外-可见检测器，P230高压恒流泵，7725i进样阀(20μL定量环)，R230溶剂管理器，EC 2006色谱数据处理工作站，Hypersil SCX色谱柱(250 mm×4.6 mm I.D. 5 μm)；超纯水仪(Sartorious，德国)，800型离心沉淀机(上海手术器械厂)。

甜菜碱标准品(纯度＞98%)；甲醇(色谱纯)购自上海星可生化有限公司；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾(分析纯)购自上海凌峰化学试剂有限公司。

虫草背孢发酵液废液(简称虫草废液)取自浙江省湖州市某制药厂。

2.2 溶液配制

甜菜碱标准溶液：取10mg甜菜碱标准品，用水溶解并定容到5ml。

虫草发酵液：取虫草发酵液废液(原液)2mL，经0.2μm水膜过滤后作为原液样品。量取原液1000mL，加入30mL(足量)预先配置好的壳聚糖絮凝剂(100mL 1%乙酸溶液+1g壳聚糖)，电磁搅拌10分钟，静置10小时。取2mL经0.2μm水膜过滤后作为上清液样品。样品冷藏保存。

虫草/甜菜碱复合饲料营养液样品溶液：取0.2mL甜菜碱标准品溶液与0.2mL虫草发酵液溶液，混合均匀后冷藏保存。

2.3 色谱条件

色谱柱：Hypersil SCX色谱柱(250 mm×4.6 mm I.D. 5 μm )；流动相：甲醇：pH5.5磷酸缓冲溶液=10：90；检测波长：205nm；柱温：室温；流速：1.0ml/min；进样量：20μL。

3.结果与讨论

3.1 虫草发酵废液的分离分析

采用HPLC进行虫草多糖及不同种类单糖的分析已经有很多种方法被发展[7,8]。其中大多使用反相色谱条件进行分离，蒸发光散射检测器检测。考虑到发酵废液基底的复杂性，一系列色谱分离条件被研究。由于样品中不仅含有生物大分子，也含有不同极性的化合物。采用2.3中的色谱条件，得色谱图如图1所示。如图中所示，样品中无甜菜碱检出。

3.2 甜菜碱的分离分析

3.2.1 甜菜碱分离谱图

甜菜碱分离检测方法较多，但多使用反相色谱和离子交换色谱的方法进行分离[9,10]。本文以1.3中的色谱条件对甜菜碱标准溶液进行了分离，结果如图2中所示。其中2号峰为甜菜碱所对应的峰。

3.2.2 线性范围及线性回归方程

取10mg甜菜碱标准品溶于1.5mL水中，分别吸取标准液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml各至1ml容量瓶，用水稀释至1mL。测定各进样浓度对应的峰面积,获得一系列对应的峰面积值,测定结果列于数据表1中。以甜菜碱的峰面积为Y纵坐标，浓度X(μg/ml)为横坐标，绘制标准曲线，应用最小二阶乘法进行计算，得标准曲线方程和相关系数,一同列于表1中。

3.3 样品分析

以2.3中的色谱条件对虫草/甜菜碱复合饲料营养液组成的样品溶液进行分析，结果如图3中所示。其中4号峰为甜菜碱，其余峰均为虫草发酵液独有，甜菜碱与虫草发酵液的峰分离度较好，可根据此法对含有虫草/甜菜碱复合饲料营养液的饲料样品进行分析。

4. 结论

将虫草/甜菜碱复合饲料营养液作为一种饲料添加剂加入饲料中不仅可以大大提高饲料中营养成分，还可以促进动物的摄食行为，使动物在短期内获得更多营养。本文发展的这种同时测定饲料中虫草发酵废液和甜菜碱含量的方法，可很好的分离甜菜碱与虫草发酵废液中各组分。为测定饲料中虫草/甜菜碱复合饲料营养液的含量提供了较好的分离分析平台。

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