ApoTome光学成像系统

刘进 席超

北京师范大学生命科学学院

光学切片显微技术已被广泛地应用于生物样本的三维荧光成像。目前最为常用的光学切片显微技术是激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope, CLSM），CLSM利用点扫描的方法获得清晰的光学切片。1997年，M. A. A. Neil等介绍了另外一种光学切片成像技术——结构光学显微镜（structured illumination microscopy, SIM），利用该方法可以在一台普通的荧光显微镜上实现光学切片成像[1]。

1.SIM成像原理

普通荧光显微镜在观察较厚的生物样本时，例如观察组织切片中的多层细胞。由于受非焦平面杂散荧光的干扰，使得所获取的荧光图像变得模糊、对比度不够、图像信噪比不过高。甚至有时候一些很重要的结构因此被掩盖在背景之中，而无法被观察到。SIM是将刻有均匀暗条纹的栅格插入荧光光路中（光路图如图1所示），因此从显微镜中观察到的焦平面的图像中有条纹的投影。带有栅格的图像中包含了样本不同结构与焦平面不同距离的信息。有些样本的结构在焦平面内，而有的在焦平面的上方或者下方也进入了焦平面内。来自非焦平面的荧光信息在图像中显示为比较模糊的区域。当栅格移动时，这部分区域的来自焦平面荧光信号的亮度（对比度）会显著提高，而来自非焦平面荧光信号的亮度仍然是比较模糊的。根据这种亮度的差异，可以用来区分荧光信号是否来自于焦平面，最后再用一种算法公式通过图像处理软件将三张原始图片进行计算和整合，最终得出一张全部来自焦平面荧光信号的清晰图像。该方法也被称为条纹投影成像技术[2,3,5,6]。

2.ApoTome光学成像系统介绍

德国ZEISS公司基于SIM的成像原理研发出了ApoTome光学成像系统，该系统就是应用条纹投影成像技术来去除非焦平面荧光影响的。

一套ApoTome光学成像系统主要由以下几个组件所组成。

2.1 一台普通的正置或倒置荧光显微镜

显微镜上要求预留有安装ApoTome插片的位置，例如ZEISS公司的Axio Imager.Z1/D1、Axio Observer.Z1/D1等产品均可扩展成为ApoTome成像系统。

2.2 ApoTome插片

ApoTome插片中装有高精度的马达和条纹栅格，ApoTome插片中的马达可以使栅格移动至三个特定位置，每个位置可以获得三张不同的数码原始图像。

2.3 ApoTome校准工具箱

工具箱中配有相应的校准工具，用于相位校准和栅格焦距校准。

2.4 数码相机、计算机和AopTome控制软件

用于获取原始荧光图像，并经计算机处理之后生成一张最终的清晰图像。

3.ApoTome成像效果及特点

ApoTome成像系统所收集的原始图片如图2所示，原始图片中包含了荧光信号信息和均匀的暗色条纹。三张图像经过计算机处理之后可以生成一张最终图像如图3所示。不使用ApoTome成像系统所获取的普通荧光图像如图4所示。经对比之后不难发现，经ApoTome成像系统所获取的图像与普通荧光图像相比，在去除原始图像中的栅格投影后能有效地去除非焦平面的杂散荧光，显著地增强了图像的锐利度和对比度。

（以上由Axio Oberver Z1显微镜、EC Plan-Neofluar 63x/1.25 Oil物镜所成像）

ApoTome成像系统主要具有以下特点：

3.1 图像收集和处理的时间较短

由于ApoTome成像系统采用的是宽场照明成像，所以与CLSM的点扫描成像相比所需的时间相对较快。其图像处理的时间取决于图像的大小，一张512×512图像约需30ms，一张1300×1000图像约需100ms[7]。

3.2 图像的纵向分辨率均一性较好

Arwed Weigel等比较了ApoTome成像系统与CLSM的分辨率差异。研究结果表明，观察荧光微球时，ApoTome的纵向分辨率不如CLSM，而横向分辨率与普通宽场荧光显微镜相比有很大的改善；观察较均匀的荧光切片时，ApoTome的纵向分辨率的均一性要优于CLSM[8]。

4.展望

ApoTome系统可以从荧光样本中获得光学切面。非焦平面的荧光能被很好地去除，可以增强图片的锐利度，增强信噪比（对比度），增强轴向的分辨率。同时可使用传统荧光光源，不需使用昂贵的激光，研究者可以最经济的成本获得消除荧光影像非焦面杂光的功能。另由于软件运算时间大大地减少，且不必要采集Z轴多层影像即可做锐化的运算处理，研究者得以迅速判断所采集的影像的样本优劣，并迅速从中获得更精确的信息，大大提高了研究的效率。最近也有研究者用非线性的栅格替代线性的栅格[4]，或者将栅格投影从二维扩展到三维投影，这些改进措施都进一步提升了SIM的成像分辨率，有的已经甚至超过了传统的CLSM。随着，SIM的技术不断创新和发展，SIM必将在生命科学研究领域做出更大的贡献。

[1]M. A. A. Neil, R. Ju?kaitis R, and T. Wilson, Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope, Opt. Lett. 1997 22: 1905-1907.

[2]L. H. Schaefer, D. Schuster, J. Schaffer, Structured illumination microscopy: artefact analysis andreduction utilizing a parameter optimization approach, Journal of Microscopy, 2004, Vol. 216,165-174.

[3]Brakenhoff GJ, Wurpel GW, Jalink K, Oomen L, Brocks L, Zwier JM.,Characterization of sectioning fluorescence microscopy with thin uniform fluorescent layers: Sectioned Imaging Property or SIPcharts., J Microsc. 2005 Sep;219(Pt 3):122-32.

[4]Mats G. L. Gustafsson, Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution, PNAS 2005 vol. 102 no. 37 13081-13086.

[5]José-Angel Conchello, Jeff W Lichtman, Optical sectioning microscopy, Nature Methods 2, 2005, 920 - 931.

[6]Fr′ed′eric Chasles, Beno^it Dubertret and A. Claude Boccara.,Optimization and characterization of astructured illumination microscope, OPTICS EXPRESS,2007, Vol. 15, No. 24 16140.

[7]AxioVison User’s Guide, 2008.

[8]A Weigel, D Schild, A Zeug, Resolution in the ApoTome and the confocal laser scanning microscope: comparison, Journal of Bio medical Optics, 2009,14, 014022.