子宫内膜异位症在位和异位内膜组织蛋白酶D的研究

金海燕 周龙书 黄丕英

具有活性的子宫内膜组织出现在子宫内膜以外部位时称为子宫内膜异位症(endometriosis，EMT，简称内异症)。经典的子宫内膜种植学说提出，经血中所含的子宫内膜碎片可随经血逆流，经输卵管进入腹腔，种植于卵巢和邻近的盆腔腹膜，并在该处继续生长和蔓延，形成内异症。逆流入盆腔的内膜细胞与腹膜粘附后，必须降解细胞外基质才能植入腹膜［1］。组织蛋白酶D能降解细胞外基质、糖蛋白及细胞连接，从而促进细胞侵袭，与乳腺癌和子宫内膜癌的生长和转移密切相关［2，3］。内异症具有侵袭性强，种植生长、远处转移和易复发等类似恶性肿瘤的特点，被称为是一种“良性癌症”，其发生学上的子宫内膜种植学说与肿瘤细胞的播散很相似［4］。因此，本研究测定组织蛋白酶D在正常子宫内膜、内异症在位及异位内膜中的表达，以探讨组织蛋白酶D在内异症发病中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 卵巢子宫内膜异位囊肿囊壁、内异症在位子宫内膜取自11例育龄妇女，除子宫内膜异位症外，无其他内、外科疾病。术前3个月内未使用内异症治疗药物、性激素类药物或放置宫内节育器。其中内异症在位子宫内膜增殖期6例，分泌期5例。

1.1.2 正常子宫内膜 取自月经周期规律的育龄妇女，有正常妊娠生育史，末次月经时间记忆准确，因盆腔良性疾病行子宫切除术的非内异症患者。术前3个月内未使用性激素类药物或放置宫内节育器，无其他内、外科疾病。术后经病理学检查子宫内膜未发现病理学改变。其中增殖期11例，分泌期10例。

1.2 免疫组织化学方法 标本行石蜡包埋，切片经微波炉抗原修复20 min后用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶(SP)法进行染色。采用DAB同步浸染显色法［5］使所有切片显色时间相同。实验设阳性对照及阴性对照。兔抗人组织蛋白酶D为Zymed Biotech产品，S-P免疫组化通用试剂盒为Maxin Biotech产品，均为即用型。

1.3 图像分析 用阳性单位(positive unit，PU)定量表达免疫组化阳性反应程度。将排除了切片本底因素后的纯免疫组化反应程度按灰度图像分为0到100个等级，每一个等级定义为1个PU。PU值大小与阳性反应程度成正比。在Leica Q550 IW图像分析系统上测试在位和异位子宫内膜腺上皮的灰度值 Gα和背景的灰度值 Gβ，按公式PU=［(Gα-Gβ)/Gmax］×100计算PU值。Gmax为检测仪器的最大灰度，等于256。每张染色片随机测试10个视场［6］。

1.4 统计学分析 用SPSS 10.0医学统计软件进行统计学分析。内异症在位子宫内膜和正常子宫内膜腺上皮之间的比较采用单因素方差分析，卵巢子宫内膜异位囊肿异位腺上皮和同组患者在位子宫内膜腺上皮之间的比较采用秩和检验。

2 结果

2.1 正常子宫内膜和内异症在位子宫内膜组织蛋白酶D的表达 组织蛋白酶D主要表达于子宫内膜的腺上皮细胞和腔面上皮细胞，分散于间质细胞，阳性产物主要位于胞浆内。正常子宫内膜和内异症在位内膜腺上皮的组织蛋白酶D存在明显的周期性变化，分泌期明显高于增殖期(P＜0.05)(图1，图2)。但内异症在位内膜腺上皮组织蛋白酶D的含量与同期正常子宫内膜比较，差异无显著性(P＞0.05)。见表1。

表1 正常子宫内膜和内异症在位内膜腺上皮组织蛋白酶D的含量(PU，±s)

表1 正常子宫内膜和内异症在位内膜腺上皮组织蛋白酶D的含量(PU，±s)

注:与组1相比较，aP＜0.01;bP=0.90;与组4相比较，dP＜0.01;cP=0.50

组别 例数 组织蛋白酶D正常增殖期子宫内膜111 16.44±1.56正常分泌期子宫内膜 2 10 19.93±2.42ac内异症在位增殖期子宫内膜 3 6 16.54±2.20bd内异症在位分泌期子宫内膜4520.50±1.81

2.2 内异症异位内膜组织蛋白酶D的表达卵巢子宫内膜异位囊肿中异位内膜腺上皮组织蛋白酶D的表达(PU=22.62 2.34)(图3)，与同组患者的在位内膜(PU=18.53 2.31)相比显著升高(P＜0.05)。

图1 内异症在位增殖期子宫内膜腺上皮组织蛋白酶D的表达(×100)图2 内异症在位分泌期子宫内膜腺上皮组织蛋白酶D的表达(×100)图3 卵巢子宫内膜异位囊肿异位腺上皮组织蛋白酶D的表达(×250)

3 讨论

子宫内膜与腹膜建立接触并进一步侵犯腹膜的机制是认识内膜细胞异位种植的重要分子基础。内异症患者的腹腔液中Ⅲ型胶原碎片增加，进一步说明内异症侵犯细胞外基质而降解细胞外基质成分的蛋白酶活性增强［7］。组织蛋白酶D是天门冬氨酸蛋白酶类的一种，属酸性蛋白酶，也是一种溶酶体酶，广泛存在于不同的组织细胞和肿瘤细胞，能催化降解细胞外基质、糖蛋白及细胞连接，从而促进细胞侵袭。它是酸性环境中癌细胞分泌最多的蛋白水解酶，与许多肿瘤侵袭和转移密切相关。有研究证实其活性与乳腺癌的生长和转移有关［2］。组织蛋白酶D的浓度与子宫内膜癌侵袭深度呈正相关，与其分化程度呈负相关［3］。

本研究结果显示，组织蛋白酶D也表达于子宫内膜的腺上皮细胞，内异症在位内膜腺上皮组织蛋白酶D的表达与正常子宫内膜无明显差异，但内异症异位腺上皮组织蛋白酶D的含量却显著高于内异症的在位内膜。文献报道，内异症患者的腹腔液中组织蛋白酶D含量也明显增加［8］。组织蛋白酶D具有破坏宿主间质天然屏障的作用，异位子宫内膜腺上皮细胞通过组织蛋白酶D的高表达，使异位内膜具有很强的蛋白水解能力，能够降解异位内膜周围的基底膜及其他细胞外基质成分，破坏腹膜基质细胞的连接，进而侵犯腹膜及病灶周围的结缔组织，使异位内膜在腹膜内种植生长并使病灶不断扩大。

［1］Kim HO，Yang KM，Kang IS，et al.Expression of CD44s，vascular endothelial growth factor，matrix metalloproteinase-2 and Ki-67 in peritoneal，rectovaginal and ovarian endometriosis．J Reprod Med，2007，52(3):207-213．

［2］Ohri SS，Vashishta A，Proctor M，et al．The propeptide of cathepsin D increases proliferation，invasion and metastasis of breast cancer cells．Int J Oncol，2008，32(2)，491-498．

［3］Bradley WH，Lima PH，Rodgers L，et al．Endometrial carcinoma expresses an increased cathepsin B/D ratio．Gynecol Oncol，2008，108(1)，84-89．

［4］Quinn M．Endometriosis:the elusive epiphenomenon．J Obstet Gynaecol，2009，29(7):590-593．

［5］廖剑辉．DAB同步浸染显色法在免疫组织化学中的应用．暨南大学学报，1996，17:55-56．

［6］申洪．免疫组织化学染色定量方法研究(Ⅲ)．中国组织化学与细胞化学杂志，1995，4(1):89-92．

［7］Pitsos M，Kanakas N．The role of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of endometriosis． Reprod Sci，2009，16 (8):717-726．

［8］Hudelist G，Keckstein J，Wright JT．The migrating adenomyoma:past views on the etiology of adenomyosis and endometriosis．Fertil Steril，2009，92(5):1536-1543．