盐酸吡格列酮片含量测定方法学的研究

庄文斌 曾晨笛 杨爱群 肖文豪 陈吉生

盐酸吡格列酮是目前最新的噻唑烷二酮类药物，近年来，随着越来越多人对盐酸吡格列酮的研究，其制剂开发、含量测定方法学也逐渐有报道，但由于中国药典2005版和2010版，均无收录盐酸吡格列酮，查阅文献，关于盐酸吡格列酮片含量测定方法，采用流动相的有机相大多数为乙腈，由于乙腈价格昂贵、对人体的毒性较大［1］。为有效控制其质量标准，本文通过方法学摸索，开发出简单、快速、经济、低毒及灵敏度高的测定盐酸吡格列酮片含量的方法，为进一步开发盐酸吡格列酮新的制剂提供质量控制参考。

1 仪器与试剂

仪器:Waters高效液相色谱系统(沃特Water科技上海有限公司):1525泵，2487可变波长紫外检测器，Breeze色谱工作站。盐酸吡格列酮对照品(中国药品生物制品检定所，批号:100634－200401);盐酸吡格列酮片(15 mg/片，日本武田药品工业株式会社，分装批号:070401;081101;090101);试剂:甲醇为色谱纯;乙醇、氨水均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的摸索和确定 参考文献所记载的盐酸吡格列酮的测定方法［2］，通过对流动相品种、流动相配比、流速、最大检测波长、pH值等进行摸索，根据峰形、峰面积等指标确定的色谱条件为:色谱柱:Symmetry C18柱(4.6 mm×150 mm);流动相:甲醇:水(80:20)，用新配置的氨试液将pH值调至7.0;流速:1.0 ml/min;紫外检测波长:224 nm;柱温:室温;进样量20 l。色谱图见图1。

2.2 方法学的验证

2.2.1 标准曲线的制备 精密称取相当于10 mg的盐酸吡格列酮对照品，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，配成浓度为0.1 mg/ml的溶液。分别精密量取该溶液10 ml、8 ml、6 ml、5 ml、3 ml、1 ml，各置 10 ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀。按“2.1”项的色谱条件，分别进样三次测定。测得各浓度对应的峰面积，以盐酸吡格列酮的峰面积(A)对浓度(c)进行线性回归，结果表明，盐酸吡格列酮在10～100μg/ml浓度范围内与峰面积线性关系良好。回归方程为:A=5e+7c+42096;R2=0.9995。

图1 盐酸吡格列酮色谱图

2.2.2 稳定性试验 参考中华人民共和国药典稳定性实验的指导原则［3］精密称取约相当于5 mg的盐酸吡格列酮对照品，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，配成浓度为0.05 mg/ml的溶液。在本实验条件下分别在室温放置不同时间(0、1、2、4、6、24 h)，按“2.1”项的色谱条件，分别进样三次测定，测得各时间点对应的盐酸吡格列酮峰面积，计算RSD=0.96%，表明盐酸吡格列酮的乙醇溶液在24 h内基本稳定。

2.2.3 精密度的考察 精密称取约相当于5 mg的盐酸吡格列酮，置100 ml容量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，配成浓度为0.05 mg/ml的溶液。在“2.1”项的色谱条件下连续进样6次测定，其峰面积的RSD=0.36%(n=6)。

2.2.4 灵敏度-最低检测限的考察 按照“2.1”项的色谱条件，取溶解盐酸吡格列酮的乙醇溶液，进样20 l三次，作为空白溶液色谱图，根据样品出峰时间，取样品出峰附近的一段基线来计算燥声，测得基线噪音为1957，再配制浓度约为0.01 mg/ml盐酸吡格列酮样品溶液。分别精密量取该溶液8 ml、6 ml、5 ml、3 ml、1 ml，各置 10 ml容量瓶中，用乙醇定容，按“2.1”项的色谱条件，分别进样三次测定，记录出峰处信号值，见图12，在上述色谱条件下，以S/N=3计算得盐酸吡格列酮的最低检测限为0.08μg。

2.2.5 回收率试验 取已知含量的盐酸吡格列酮片20片，精密称定，研成细粉并混匀后，分别精密称取约相当于盐酸吡格列酮4、5、6 mg，各置200 ml量瓶中，精密加入盐酸吡格列酮对照品5 mg，加溶剂溶解并定容，摇匀，作为回收率测定用溶液，按“2.1”项的色谱条件，分别进样三次测定，记录峰面积。由公式:回收率=(测得量-样品中含量)/标准品加入量，计算出回收率。

图2 盐酸吡格列酮在最低检测限浓度下的出峰情况

表1 盐酸吡格列酮的回收率

2.3 样品测定 取盐酸吡格列酮片20片，精密称定，研成细粉取细粉适量(相当于盐酸吡格列酮5 mg)，精密称定，置100 ml量瓶中，用乙醇溶解，超声5 min使溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，制成每1 ml中约含盐酸吡格列酮0.05 mg的溶液。按“2.1”项的色谱条件，测定本品三批，分别进样三次测定，记录峰面积，再根据标准曲线计算含量，结果如下:

表2 3个批次的盐酸吡格列酮片的含量

3 讨论

3.1 采用HPLC法测定盐酸吡格列酮片的含量，最首要的是选择合适的色谱条件和测定方法，作为HPLC的流动相，如果选择粘度较高的溶剂，会在分析时产生很高的压力，导致柱子的损坏加快。在有机溶剂与水混合的时候，根据混合比例的不同，所产生的粘度(=压力)的比例也会不同。在实验中发现，当甲醇与水的比例为50:50时，会产生很高的柱压，通过调节比例得出，甲醇与水的比例往两级增大，柱压会下降。在洗脱能力上，乙腈比甲醇的洗脱能力强［4］，因此使用甲醇代替乙腈时，需要增大甲醇的比例，每次将甲醇的比例增加5%，再选择哪个比例可以到分离要求，试验结果显示，当甲醇:水=80:20时，盐酸吡格列酮片峰形及出峰时间合适，因此确定流动相的比例为甲醇:水=80:20，验证结果表明，该流动相适合用于盐酸吡格列酮片的含量测定。

3.2 应用HPLC法进行分析测定时，常常采用离子抑制法即向含水流动相中加入弱酸、弱碱或者缓冲溶液等改性剂，以使流动相的pH值控制一定数值，抑制溶质的离子化，减少谱带拖尾、改善峰形，以提高分离的选择性［5］。

3.3 通过验证实验确认，本文所用的盐酸吡格列酮含量测定方法学各项目均达到要求，且本测定方法简便，片剂不需提取分离，直接溶解过滤即可直接进样，测定时间短，只需8 min即可完成测定，流动相简单、毒性低、价格便宜，方法准确、重现性好、精密度高，具有较好的推广应用价值。

［1］钱伯章．全球乙腈生产紧缺．合成纤维，2009，06:53．

［2］朱鹏祥，钱南萍，魏润新，等．盐酸吡格列酮片的HPLC含量测定方法．江苏药学与临床研究，2004，12(6):15-16．

［3］国家药典委员会．中华人民共和国药典2005年版第二部．化学工业出版社，2005，附录:172．

［4］高效液相(HPLC)流动相乙腈与甲醇的区别，生物信息网，实验室安全专栏，http://www．biowww．com．cn/shiyan/safe/1970．html．

［5］宋永康，郭嘉，潘葳．影响测定反相高效液相色谱流动相pH值的因素．现代科学仪器，2005，1:95-97．