COX-2和BCRP在非霍奇金淋巴瘤中表达的意义

赵永峰 苏丽萍 郑美婧 段静静

非霍奇金淋巴瘤治疗的主要方法是化疗。化疗方法的选择于淋巴瘤的组织病理学及与之相关联的化疗前预后风险的评估。尽管近30年来，非霍奇金淋巴瘤患者的生存率提高了30%以上且大多数的患者都达到了原发缓解，但目前的治疗方法仍无法让人满意。非霍奇金淋巴瘤治疗失败的原因是多药耐药(multidrug resistance，MDR)。

MDR是指由一种药物诱发，但同时又对其他多种结构和作用机制迥异的抗癌药物产生交叉耐药［1］。乳腺癌耐药蛋白(BCRP)是近年发现的一种耐药相关蛋白，与P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白(MRP)同属ABC转运蛋白超家族，其过表达使肿瘤细胞对蒽环类药物、羟基喜树碱等产生抵抗［2］。Patel等［3］的研究表明:COX-2 可以上调 P 糖蛋白的表达。在对卵巢癌及乳腺癌的研究中发现COX-2与P糖蛋白的表达明显相关［4，5］。临床及实验数据表明COX-2抑制剂的使用有助于提高癌细胞对化疗药物的敏感性［6-9］。目前，在非霍奇金淋巴瘤关于COX-2和BCRP在多药耐药方面的研究报道较少，本实验通过对61例非霍奇金淋巴瘤患者COX-2蛋白及、BCRP基因表达及治疗反应报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集本院2008年9月至2009年7月收治的61例NHL患者，男35例，女26例，年龄18～81岁，中位年龄54岁。所有患者均经过病理切片形态观察、免疫组化确诊，病理分型按2001年WHO肿瘤分类，其中含56例B细胞淋巴瘤，5例T细胞淋巴瘤。依据Ann Arbor系统对疾病的临床进展分类，I/II期36例，III/IV期25例。所有患者均接受6-8个疗程的R-CHOP方案化疗，其中31例化疗敏感，30例化疗耐受。在对数据分析时，依据IPI评分标准分为4组:低危组、中低危、中高危组以及高危组。10例反应增生性淋巴结炎作为阴性对照组。

1.2 设备及仪器 主要检测仪器:Perkin Elmer公司lamddaBio10型紫外分光光度计，PE2400型。PCR扩增仪，Gene公司GDS-8000PCA凝胶成像分析系统。试剂:鼠抗人COX-2抗体及DAB显色试剂盒均购于北京中山公司，SP免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。Trizol为Gibco产品，逆转录试剂盒购于Promega公司。BCRP上游引物:5’-AGATCAGCTACACCACCTCC-3’，下 游 引 物:5’-ACCCCGAACACCTTCTTA-3’，产物长度791bp;β-actin上游引物5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’: 下 游 引 物:5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，产物长度1359bp。

1.3 免疫组化 所有标本经10%福尔马林液固定，石蜡包埋，连续4 μm厚度切片。SP法染色步骤严格按照SP试剂盒说明进行。已知COX-2阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。结果判定:COX-2主要于淋巴瘤瘤细胞的胞浆内，计数高倍视野下1000个以上肿瘤细胞中阳性肿瘤细胞所占的百分比，以阳性细胞计数＞10%判定为COX-2表达阳性。

1.4 RT-PCR 手术获得淋巴结标本后立即放入液氮或-70℃低温冰柜中保存。所有标本均经临床病理证实TRIZOL提取法提取细胞总RNA紫外线分光光度计定量RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录为CDNA。BCRP基因PCR条件:用β-actin作内参照，按RNA PCR Kit(AMV)试剂盒说明书操作。反应总体积为25μL，反应条件为94℃预变性2 min;94℃ 30 s，55℃30 s，72℃1 min，共 35 个循环;最后一循环于72℃5 min。取15μL产物用MCF一7/ADR做阳性对照进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，将结果扫描、照象。同时，实验设阳性对照组:乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR中BCRPmRNA的表达作为阳性对照。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件处理实验数据，采用χ2检验对数据进行分析，以P＜0.05为统计学有意义。

2 结果

2.1 COX-2蛋白和BCRP mRNA在非霍奇金淋巴瘤中的表达 COX-2蛋白在非霍奇金淋巴瘤中的阳性表达率为50.8%，BCRP基因在非霍奇金淋巴瘤中的阳性表达率为45.8%，COX-2蛋白与BCRP基因在NHL的表达与对照组相比，差异有显著性，(P＜0.05)。

2.2 COX-2蛋白和BCRP mRNA在NHL中表达的相关性在31例COX-2蛋白表达阳性的NHL患者中，BCRP mRNA阳性表达20例，而30例在COX-2阴性表达的NHL患者中，BCRP mRNA阳性表达仅8例。经检验COX-2蛋白和BCRP mRNA 表达呈正相关，χ2=8.795，r=0.355，P＜0.05。

2.3 COX-2蛋白和BCRP mRNA的表达与临床特征的关系COX-2和BCRP在NHL中的表达与临床特征如年龄、性别、IPI、LDH、β2-微球蛋白等无明显相关性(P＞0.05)，而与Ann Arbor分期 III/IV明显相关(P＜0.05)，见表1。

表1 COX-2蛋白和BCRP mRNA在NHL中的表达与临床特征的关系

3 讨论

我们研究了非霍奇金淋巴瘤患者COX-2蛋白和BCRP mRNA的表达，并对这些因子的表达与临床病理参数之间的潜在的相关性进行了分析。在50.8%的非霍奇金淋巴瘤病例中发现有COX-2的表达;在45.8%的病例中发现有BCRP的表达。

环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)是前列腺素合成过程中一个重要的限速酶。人体环氧化酶主要有两种异构体:COX-1和COX-2。COX-1为结构型酶，在机体中稳定表达，维持机体正常生理功能。COX-2是花生四烯酸代谢过程中的一个关键酶，在正常组织中表达阴性或弱阳性，但在细胞受到各种致癌物刺激后表达上调。COX-2的过度表达促进了多种肿瘤的发生和发展(结肠癌，食道癌，胃癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，皮肤癌，前列腺癌［10-17］，COX-2具有抗凋亡和促进肿瘤血管生成的作用。最近研究发现COX-2还可能具有调控肿瘤多药耐药的作用，是恶性肿瘤重要的预后不良因素之一。本实验中，在50.8%的非霍奇金淋巴瘤病例中发现有COX-2的表达，提示其在非霍奇金淋巴瘤发病机制中发挥作用，这与其他的一些恶性肿瘤相似。在这项研究中，肿瘤细胞COX-2的过度表达与非霍奇金淋巴瘤患者的临床和/或病理学数据之间没有发现相关性。

乳腺癌耐药蛋白(BCRP)是与药物泵出有关的ABC膜转运蛋白超家族中又一新的成员，首先由于Doyle等［18］1998年从有耐药现象，但无P蛋白以及MRP1表达的乳腺癌细胞MCF-7/ADR发现的一种新的药物转运蛋白，该蛋白可将多种化合物从细胞内排出。Yoh等［19］采用免疫组化方法检测72例确诊为ⅢB和Ⅳ期非小细胞性肺癌的老年人的肿瘤标本中BCRP蛋白的表达，阳性率为46%。与顺铂为主的联合化疗疗效的相关性分析提示，BCRP阴性者与BCRP阳性者有效率不同，两者间差异无统计学意义(P=0.08)。在本实验中，我们的研究已经证明了BCRP在非霍奇金淋巴瘤的表达与临床效应之间存在正相关。同时，我们观察到BCRP与COX-2在非霍奇金淋巴瘤表达明显相关，提示 COX-2在BCRP介导的非霍奇金淋巴瘤多药耐药中可能发挥重要作用。

总之，COX-2与ABC转运体蛋白BCRP之间的正相关，对于开展将COX-2抑制剂运用于提高非霍奇金淋巴瘤的化疗敏感性的远期临床调查打下基础。应用相对价廉的COX-2抑制剂可能在很大程度上提高非霍奇金淋巴瘤细胞对化疗的敏感性。既然BCRP的表达与临床反应相关，那么ABC转运体似乎参与了非霍奇金淋巴瘤细胞的初始耐药。BCRP作为非霍奇金淋巴瘤患者化疗反应和复发危险性的预测因子，在临床上有潜在的应用价值。

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