毛细管电泳法测量清热化毒丸中盐酸小檗碱的含量

王维庭 房娟娟 闫滨

清热化毒丸由连翘、青黛、黄连、大黄、菊花等15味药物组成，具有清火化毒，消肿止痛的作用。用于小儿身热烦躁，咽喉肿痛，口舌生疮，皮肤疮疖口臭便秘，疹后余毒未尽等症状。盐酸小糪碱是清热化毒丸中主要活性成分之一，以抗菌消炎为主。

近年来分析小檗碱型生物碱的方法分别有反向高效液相色谱法［1］，离子交换色谱法［2］，胶束色谱法［3］，薄层色谱-荧光分光光度法等。但此样品成分复杂，且盐酸小檗碱为季胺类生物碱，碱性强，极性大，往往被色谱柱吸附，影响峰形，对色谱柱造成很大污染，高效毛细管电泳(HPCE)以其高效灵敏、分离速度快、样品量小、消耗仅微量等优点已越来越多的用于中药成分分析及测定中。本文通过对清热化毒丸中盐酸小糪碱的毛细管电泳条件进行摸索，建立了盐酸小糪碱含量测定的高效毛细管电泳方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Beckman P/ACE 5500型高效毛细管电泳仪(美国Beckman公司)，配备UV检测器，Chemical Station工作站;酸度计Model PHS-2CA(上海大中分析仪器厂);超声清洗器KQ-500E(江苏昆山市超声仪器有限公司);万分之一电子天平(METTLER-TOLEDO中国);涂层熔融石英毛细管柱(47 cm×75 m，河北永年光导纤维厂)。

1.2 试剂 盐酸小檗碱对照品(批号:110713-200609)购于中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯(天津市广成化学试剂有限公司)，水为自制重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。所需清热化毒丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号:9013395)，购自药店。

2 含量测定

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成1 mg/ml的对照品溶液，4℃保存备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取清热化毒丸2丸，剪碎，称取3.0065 g置于100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称重后超声(功率250 W，频率30 kHz)处理30 min，放冷，称定重量，必要时用甲醇补足失重，过滤。滤液自然挥干后用甲醇溶解，转移至5 ml容量瓶中，加入2 ml缓冲液后用甲醇定容，最后用0.45 μm有机膜过滤备用。

2.2 电泳条件 涂层熔融石英毛细管柱(47 cm×75 m，有效长度为40 cm);检测波长为200nm，进样:氮气压力(586 KPa)自动进样5 s，分离电压为30KV，柱温25℃，缓冲液体系为60 mmol/L磷酸缓冲溶液-甲醇(65:35)，调节 pH值为3.2。

2.3 线性关系考察 精密称取盐酸小檗碱对照品适量分别于10 ml容量瓶中，加入2 ml缓冲溶液，用甲醇定容至刻度得 0.05，006，0.07，008，0.09，0.10 mg/ml的对照品溶液，依次进样，以对照品浓度为横坐标对峰面积做回归分析，得回归方程为Y=1000000x-8143.9，r=0.9993。结果表明盐酸小檗碱在0.05～0.10 mg/ml范围内线性关系良好，(对照品色谱图见图1)。

图1 盐酸小糪碱毛细管电泳色谱图

2.4 精密度试验 取0.1 mg/ml盐酸小糪碱对照品溶液，在上述电泳条件下，连续进样5次，以峰面积计算RSD为0.50%，表明在此条件下精密度良好。

2.5 稳定性试验 取供试品溶液一份，分别于0，2，4，8，10 h测定样品的峰面积，求得RSD值为1.29%，实验表明供试品在10 h内稳定性良好。

2.6 回收率测定 取5份已知含量的供试品溶液，加入适量对照品，按“2.1.2”项下的方法制备，通过HPCE进行测定，结果见表1。

表1 清热化毒丸中盐酸小糪碱加样回收率(g，mg，%)

2.7 样品含量测定 按“2.1.2”项方法制备供试品溶液3份，在上述电泳条件下，每份进样两次取平均值，得盐酸小檗碱的含量测定结果为0.1357 mg/g(样品色谱图见图2)。

图2 清热化毒丸中盐酸小糪碱毛细管电泳色谱图

3 讨论

3.1 缓冲溶液的选择 由于盐酸小檗碱为季胺类生物碱，带有正电荷，用磷酸氢二钠做为缓冲液可使其保持带有正电荷，不同的缓冲液及不同的比例会影响成分之间的分离度。本实验先后在硼砂-甲醇及磷酸二氢钠-甲醇不同浓度缓冲体系下进行电泳分离，发现60 mmol/L磷酸二氢钠-甲醇(65:35)的缓冲体系分离度较高，可达到良好的分离效果。

3.2 pH值的选择 在毛细管电泳中，电渗流对pH值有较强的依赖性，直接影响待测成分的出峰时间，pH值降低，缓冲液呈酸性时，电渗流减弱，成分出峰时间延后，pH值升高，缓冲液偏碱性时，电渗流增强，成分出峰时间提前。并且离子的电泳淌度跟有效电荷成正比，极易受缓冲溶液pH值影响，因此缓冲溶液的pH值调节与控制是优化分离的重要对策。同时缓冲溶液的pH值也会影响离子的有效电荷，从而间接影响分离效果。在硼砂-甲醇(85:15)缓冲体系(pH=9.0)中，样品的出峰时间短，但未能达到基线分离。本实验又分别考察了磷酸二氢钠缓冲体系(pH值分别为3.0、4.0、5.0)对分离效果的影响。结果表明，pH值为3.0时有良好的分离效果。

3.3 分离电压的选择 本试验考察了电压为15 KV～30 KV时的影响。结果表明:电压低时，基线稳定，但样品的分析时间延长，峰形变宽;随着电压的增加，样品的迁移时间缩短，峰型窄，分离效果好，但基线噪音有所增大。基于对迁移时间和基线的综合考虑，本试验最终选用30 KV作为分离电压。

3.4 毛细管有效柱长的选择 熔融石英毛细管柱长是改变出峰时间的主要因素之一，一般目标成分的出峰时间控制在15 min以内为宜。本实验考察了有效长度为40 cm、50 cm、60 cm的毛细管对出峰时间的影响，结果表明，三者对于目标组分均有良好的色谱峰形和分离度，但40 cm柱长出峰时间在5 min左右，较为快速，因此优先选择40 cm柱长毛细管。

综上所述，在目前分析黄连药材及其复方制剂的较常用的含量测定方法中，高效液相色谱法应用最为广泛，薄层层析方法已经较为少见。高效液相色谱法分离具有重现性好，分离效果稳定、灵敏度高的优点，但是由于小糪碱是季胺碱，碱性强，极性强，易离子化，且易使液相色谱柱中的ODS染色，需要大量溶剂冲洗且耗时较多，而且由于黄连中含多种季胺碱，极性类似，液相色谱不易将其分开，相互之间易造成干扰。HPCE的区带电泳模式，由于使用熔融石英毛细管空管，不怕污染和堵塞，易清洗，且有分离效率高，样品需要量极少的特点，仅使用简单少量的缓冲液，几乎不产生废液，分析耗费低，样品预处理简单，几乎可称为绿色分析方法，尤其适合于基质比较复杂，结构近似的药用植物成分的分析。在本实验中，可同时分离黄连中的7个季胺生物碱，专属性和分离度良好，可用于该类成分的指纹图谱研究。HPCE既可结合质谱技术建立复方药物指纹图谱，又可进行多种有效成分或指标成分定量，还可用于体内药物分析，开展有效成分研究。HPCE分离分析药用植物成分的发展具有极为广阔的前景。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)．北京:化学工版社，2005:705．

［2］文欣欣，刘丹华，余陈欢，等．薄层色谱-荧光分光光度法测定黄连及香连丸中盐酸小檗碱的含量．中国中医药信息杂志，2008，15(10):54．

［3］余为，胡薏冰．高效毛细管电泳法测定紫黄止血消炎粉中盐酸小檗碱的含量．中国实用医药，2008，3(15):73．