Survivin在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

邢洪存 郭芳芳 卢振霞*

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升的趋势。研究发现，肿瘤的发生可能由癌基因的激活、抑癌基因的失活引起，也可能是细胞凋亡异常的结果[1-4]。Survivin是迄今发现最强的凋亡抑制因子，属于凋亡抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成员[5,6]。研究表明，Survivin选择性地表达于肿瘤组织，而在正常成熟组织中不表达或很少表达[7-9]。本研究旨在通过检测Survivin在结直肠癌组织中的表达情况，探讨其与结直肠癌发生、发展和预后的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料

标本取自2003年8月至2005年10月在吉林大学中日联谊医院及吉林省肿瘤医院腹科住院行根治性手术的58例原发性结直肠癌患者。所有标本均经严格筛选及2名以上医师进行病理诊断，术前均未经化疗、放疗或免疫治疗。其中男性31例，女性27例。患者年龄34～79岁，中位年龄55.8岁。结肠癌24例，直肠癌34例。低分化癌35例，中高分化癌23例。有淋巴结转移49例，无淋巴结转移9例。Dukes A期1例，B期7例，C期37例，D期13例。全部患者在手术中均采集癌组织及癌旁正常组织标本（距肿瘤边缘10cm处）各一块，立即置于液氮中冷冻，然后转移至-80℃低温冰箱中保存用于实验。

1.2 主要试剂

RNA提取及RT-PCR检测试剂盒购自Promega公司。

1.3 引物的设计及合成

根据GenBank中登录的Survivin基因序列（NM_001168）设计一对引物，P1：5'-ATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTT-3'；P2：5'-TTCCT AAGACATTGCTAAGGGGC C-3'，扩增片段长度297bp。以β-actin为内对照，设计引物序列为：P1：5'- GGACCTGAC CGACT ACCTCA-3'；P2：5'- AATCCACATCTGCTGGAAGG-3'，扩增片段长度523 bp。均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 总RNA的提取

取冰冻组织50 mg切成薄片，用冷PBS洗涤后，按RNA抽提试剂盒说明抽提总RNA。经紫外分光光度计于260nm 和280nm波长下测定吸光度值，并行RNA 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳以检测抽提纯度及完整性。

1.5 Survivin基因的RT-PCR扩增

取1μg总RNA，以用Oligo（dT）为引物按反转录试剂盒说明在M-MLV作用下合成cDNA第一链。然后以反转录产物为模板，按下述程序进行PCR反应：94℃ 5min；95℃ 1min，55 ℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.6 统计学处理

应用SPSS 10.0 统计软件对结果进行卡方检验，以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 Survivin基因mRNA在结直肠癌及癌旁正常组织中的转录水平

RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，所有标本中均有β-actin的稳定表达，说明实验结果可靠（图1）。结果显示，58例结直肠癌标本中Survivin mRNA阳性表达39例，阳性率为67.2%，而癌旁正常组织标本中则无1例表达，两者差别有统计学意义（P＜0.05）。

图1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

2.2 Survivin 表达与结直肠癌临床病理特征的相关性

统计分析表明，结直肠癌组织中Survivin基因表达与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位及组织学分化程度均无关（P＞0.05），而与Dukes分期及有无淋巴结转移密切相关（P＜0.05），见表1。

表1 结直肠癌组织中Suvivin 表达水平与临床病理特征的相关

3 讨 论

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，其发生和发展机制尚未完全阐明。目前的研究发现，肿瘤的凋亡抑制可能在结直肠癌的发生、发展中有重要的作用[3,4]。Survivin于1997年[5,6]被发现，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中分子量最小、抗凋亡作用最强的成员。研究报道，Survivin特异表达于人和鼠的胚胎发育组织以及多数人类肿瘤细胞，而在正常成人组织的表达仅见于胸腺、睾丸和分泌期子宫内膜[7-9]。它可能主要通过两种方式抑制细胞凋亡[5,10,11]：一是通过其蛋白激酶结构域特异地结合caspase-3和caspase-7而直接阻断细胞凋亡过程；二是竞争结合p21-Cdk4复合物上的Cdk4，使p21成为游离状态，游离的p21与caspase-3结合后反馈抑制caspase-3的活性，间接阻止细胞凋亡。

目前，Survivin在结直肠癌组织中的表达还未取得统一认识[12-14]。本研究应用RT-PCR方法检测了58例结直肠癌患者癌组织和癌旁正常组织中Survivin基因的表达情况，结果表明Survivin基因在58例结直肠癌组织中的阳性表达率为67.2%，而在癌旁正常组织中均不表达。提示Survivin与结直肠癌的发生有关，也可能在结直肠癌的演变过程中发挥重要作用。有研究发现，在肿瘤患者外周血的血清中提取到了Survivin抗体[15,16]，提示它可能作为一个较为普遍的肿瘤标志物用于结直肠癌及其他恶性肿瘤的早期诊断。但不无争议，Gianani等[17]报道用免疫组织化学的方法在结直肠的正常、增生、癌前病变和癌组织中均能检测到Survivin，只是表达程度不同，认为其不能作为肿瘤标志物。而学者Kawasaki等[18,19]则认为这种在大肠正常组织中不表达，而在腺瘤组织出现表达说明Survivin基因是在大肠癌发生早期阶段（腺瘤阶段）被激活并开始表达，可以认为Survivin的过度表达是结直肠上皮癌变过程的早期事件，其可作为肿瘤标志物。这方面的研究还在继续深入，在今后的临床工作中将着重这方面的研究。

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