泰索帝与阿霉素对甲状腺未分化癌细胞(TA-K)作用比较及对细胞周期的影响

付言涛,赵吉生,郑海波,刘秀云,侯信明,孙 辉*

(1.吉林大学中日联谊医院 甲状腺外科,吉林 长春 130033;2.吉林大学第二临床学院 麻醉科,吉林 长春)

泰索帝与阿霉素对甲状腺未分化癌细胞(TA-K)作用比较及对细胞周期的影响

付言涛1,赵吉生1,郑海波2,刘秀云1,侯信明1,孙 辉1*

(1.吉林大学中日联谊医院 甲状腺外科,吉林 长春 130033;2.吉林大学第二临床学院 麻醉科,吉林 长春)

目的比较泰索帝与阿霉素对甲状腺未分化癌细胞(TA-K)的增殖抑制作用,研究泰索帝对甲状腺未分化癌细胞作用的机制。方法应用MTT方法观察泰索帝与阿霉素对TA-K细胞的抑制率,应用流式细胞仪探讨泰索帝对TA-K细胞增殖周期的影响。结果泰索帝对TA-K细胞增殖抑制作用大于阿霉素,泰索帝主要是使TA-K细胞抑制于G2/M期,促进细胞凋亡。结论泰索帝对甲状腺未分化癌的抑制作用优于阿霉素,有望成为甲状腺未分化癌更为有效的化疗药物。

泰索帝;阿霉素;甲状腺癌;化疗

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1051)

甲状腺未分化癌(ATC)是甲状腺肿瘤中恶性程度最高的一种,化疗最常用的方法是含有阿霉素的方案[1-3],但其缓解率约10%,效果较差。泰索帝是第二代紫杉烷类抗肿瘤药物,已广泛应用于临床,可治疗多种恶性肿瘤,如乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌等。有实验证实,泰索帝对甲状腺未分化癌细胞系(TA-K)有抑制作用[4],但对其机制尚未见详细的报道,本研究拟通过MTT及流式细胞学等方法,比较泰索帝与阿霉素对TA-K作用强度及泰索帝对细胞周期的影响。

1 材料

1.1 细胞来源 人甲状腺未分化癌细胞系(TAK),由日本国东北大学医学部第二外科惠赠。采用含10%胎牛血清的Williams Medium E(WE)培养液,37℃、5%CO2孵箱进行培养。

1.2 主要试剂 泰索帝购自法国安万特医药公司,WilliamsMedium E为 Sigma公司,噻唑兰(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶均为美国SIGMA产品,胎牛血清为HyClon公司产品。

2 方法

2.1 TA-K细胞培养条件及培养方法 TA-K细胞接种于25 ml培养瓶内,培养液为含10%胎牛血清的WE培养液,置37℃5%CO2孵箱内,根据细胞生长状态,每2-3天更换培养液一次,培养6-7天,待细胞长满瓶底时,消化(0.25%胰蛋白酶)、离心,用WE制成单细胞悬液,调整细胞浓度,备用。

2.2 细胞增殖抑制试验 TA-K细胞接种于96孔培养板上,细胞浓度5×105/ml。设置泰索帝组、溶媒组、阿霉素组与对照组。泰索帝组,根据原有实验参数,每孔加入其药物浓度为0.01 μ g/ml及WE培养液200 μ l[4],设平行6孔;溶媒组加入与泰索帝组各浓度含有相同乙醇浓度溶媒剂WE培养液,设平行6孔 ;阿霉素组每孔加入 0.5 μ g/ml[5],设 6 孔 ;对照组6 孔 。加药后细胞孵育6 h 、12 h、24 h 、48 h 、72 小时分别取各浓度细胞,每孔加入20 μ lMTT,孵育4 h后,弃上清,加入二甲亚砜(DMSO)150 μ l,终止反应,微震荡后,于酶标仪波长570 nm处读吸光度值(OD值),抑制率=(1-试验组OD值/阳性对照组OD值)×100(%)。

2.3 流式细胞学检测 收集对照组、相同乙醇浓度的溶媒组与0.01 μ g/ml泰索帝处理后72 h的TA-K细胞,乙醇固定48 h,PBS洗涤3次,加入RNase(最终浓度100 μ g/ml),碘化丙锭(最终浓度 10 μ g/ml),4℃避光30 min,上机检测分析DNA亚二倍体的形成及细胞周期的变化,计算出了细胞凋亡率,重复5次。

2.4 统计学处理 均采用SPSS软件进行统计学处理,χ2检验。

3 结果

3.1 泰索帝与阿霉素对TA-K抑制作用比较 泰索帝组、溶媒组、阿霉素组MTT检测OD值见表1。根据OD值计算出抑制率,如图1所示,药物对TA-K的抑制率显示,6 h时泰索帝作用效果优于阿霉素(P＜0.05),12 h、24 h两者无明显统计学差异,48 h、72 h泰索帝对TA-K的抑制作用优于阿霉素(P＜0.05)。

图1 泰索帝与阿霉素作用于TA-K细胞抑制率比较

表1 泰索帝与阿霉素作用于TA-K细胞后OD值的变化

3.2 泰索帝诱导细胞周期的变化[4]TA-K细胞经0.01 μ g/ml泰索帝处理后,流式细胞仪检测提示,对照组细胞凋亡率为2.17±0.64%,溶媒组9.90±0.93%,泰索帝组32.97±6.14%,泰索帝组和溶媒组、对照组相比较,凋亡率明显增加,差异具有显著性(P＜0.05)。泰索帝组细胞G2/M期增多,凋亡率增加,较对照组有明显差异(见表2)。

表2 流式细胞仪检测细胞周期变化和细胞凋亡情况

4 讨论

本实验比较泰索帝与阿霉素对甲状腺未分化癌细胞系(TA-K)的抑制作用。实验中选取泰索帝与阿霉素对甲状腺未分化癌细胞的最佳作用浓度进行比较,12 h、24 h时两者无明显差异,随着作用时间延长,泰索帝作用效果优于阿霉素。泰索帝有望成为临床ATC化疗更为有效的药物之一。

泰索帝在通常情况下微管的聚合是在GTP以及微管联合蛋白作用下进行,并且受β-微管蛋白影响。泰索帝C13位置上酯侧连能特异地结合到微管β位上,从而导致微管在缺少GTP和其它蛋白辅因子处集中。导致微管聚合成束,使其稳定抑制微管解聚和正常重组,细胞在有丝分裂时不能形成正常的有丝分裂纺锤体。从而抑制了细胞的分裂和增殖。使细胞不能进行正常有丝分裂,而停留在G2/M期,使细胞死亡或凋亡。本组研究证实,药物作用后,TA-K细胞处于G2/M细胞增加,凋亡率明显高于对照组。

实验证实泰索帝对甲状腺未分化癌细胞的抑制作用优于阿霉素,且对甲状腺未分化癌细胞的细胞周期的影响与其他细胞系相似,使细胞停留在G2/M期,促进细胞死亡或凋亡。

[1]Williams SD,Birch R,Einhorn LH.Phase II evaluation of doxorubicin plus cisplatin in advanced thyroid cancer:a Southeastern Cancer Study Group trial[J].Cancer Treat Rep,1986,70(3):405.

[2]Asakawa H,Koboyashi T,Komoije Y,et al.Chemosensitivity of anaplastic thyroid carcinoma and poorly differentiated thyroid carcinoma[J].Anticancer Res,1997,17(4A):2757.

[3]De Besi P,Busnardo B,Toso S,et al.Combined chemotherapy with bleomycin,adriamycin and platinum in advanced thyroid carcinoma[J].J Endocrinol Invest,1991,14(6):475.

[4]付言涛,赵吉生,周 乐,等.泰索帝对人甲状腺未分化癌细胞系(TA-K)增殖抑制作用[J].中国实验诊断学,2008,12(1):16.

[5]H Asakawa,T Kobayashi,Y Komoike,et al.Establishment of anaplastic thyroid carcinoma cell lines useful for analysis of chemosensitivity and carcinogenesis[J].Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism,1996,81(10):3547.

Proliferation Inhibition Effect of Taxotere Compared with Doxorubicin on Anaplastic Thyroid Cancer Cells(TA-K)and Ef-fects of Taxotere on Cell Cycle

FU Yan-tao,ZHAO Ji-sheng,ZHENG Hai-bo,et al.(Department of Thyroid Surgery,China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun130033,China)

ObjectiveTo compare Taxotere with Doxorubicin on the proliferation inhibition effect to anaplastic thyroid cancer cells(TA-K),and investigate the mechanism of Taxotere on the anaplastic thyroid cancer cell.Methodswe observed the proliferation inhibition effect of docetaxel and Adriamycin on the TA-K cell withMTT and by flow cytometry,studyed the effect of Taxotere on the cell cycle.ResultsTaxotere is greater than Adriamycinon the inhibition rate to the TA-K cell.Taxotere prohibitsthe proliferation of TA-K cellson G2/M phase,and promotes cell apoptosis.ConclusionTaxotere is superior to Doxorubicinon the Proliferationinhibition effect to anaplastic thyroid cancer,and it may be more effective chemotherapy drug on anaplastic thyroid cancer.

Taxotere;Doxorubicin;anaplastic thyroid cancer;chemotherapy

R736.1

A

1007-4287(2010)07-1051-02

吉林省科技厅社会发展项目(200705359)

*通讯作者

2009-03-13)