产ESBLs肺炎克雷伯菌多重耐药性与I类整合子的相关性研究

郭红阳,朱光泽,连树林

(长春中医药大学附属医院,吉林长春130021)

产ESBLs肺炎克雷伯菌多重耐药性与I类整合子的相关性研究

郭红阳,朱光泽,连树林

(长春中医药大学附属医院,吉林长春130021)

目的 了解来源于不同临床标本的肺炎克雷伯菌的耐药性、携带第1类耐药整合子的特征及基因盒的种类。方法 使用常规方法分离肺炎克雷伯菌;运用法国梅里埃V ITEK细菌分析系统进行鉴定;应用PCR法扩增第1类整合子;应用纸片扩散法对22种抗生素进行耐药性监测和分析。结果 191株产ESBLs肺炎克雷伯菌中检测出I类整合子178株,检出率为93.2%,I类整合子阳性菌对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物表现出较高的耐药,其多重耐药率明显高于I类整合子阴性菌株。结论 I类整合子广泛地存在产ESBLs肺炎克雷伯菌中,I类整合子对细菌多重耐药性的产生和传播起着重要作用。

肺炎克雷伯菌;ESBLs;整合子;多重耐药

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1097)

本研究从基因水平入手检测产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌的I类整合子,通过分析细菌的耐药性,探讨在整合子参与下,细菌间耐药基因的水平转移与耐药性的关系。

1 材料与方法

1.1 样本来源

长春中医药大学附属医院2005年至2008年临床分离的419株产ESBLs肺炎克雷伯菌。

1.2 仪器及试剂

Vitek-32型全自动微生物分析仪及 G NI+细菌鉴定卡均为法国生物梅里埃公司产品;药敏纸片均购自杭州天和微生物试制有限公司;亚胺培南购自法国生物梅里埃公司;M-H琼脂为杭州天和微生物试剂公司产品。

1.3 引物设计

根据 I类整合酶序列[4]设计引物,KPintF:5-TGCGGGTTAAGG ATCTAG ATTT-3’; KPintR: 5-CAGCACATGCGTGTAG AT-3’,目的基因长度为 491 bp,由宝生物公司合成。

1.4 各样品种克雷伯菌的分离鉴定

用法国生物梅里埃公司的Vitek-32型微生物分析仪、G NI+鉴定卡进行菌株鉴定。

1.5 产超广谱β-内酰胺酶菌株表型筛查和确证试验

参照CLSI肺炎克雷伯、产酸克雷伯和大肠杆菌中ESBL s检测的筛查和确证标准,凡抑菌环头孢噻肟或氨曲南≤27 mm、头孢曲松≤25 mm、头孢泊肟或头孢他啶≤22 mm者为高度可疑株;同时使用头孢噻肟和头孢他啶,单独和联合克拉维酸复合制剂,任何一个药物,在加克拉维酸后,抑菌环直径与不加克拉维酸的抑菌环相比增大值≥5 mm,判断为产ESBLs菌株。

1.6 PCR扩增

采用改进的酚/氯仿法抽提DNA模版,以O1群霍乱弧菌SK10作为I类整合子阳性对照菌,以纯水为阴性对照。用引物 KPintF和 KPintR,反应体系为:10×ExTaq Buffer,2.5μl;dNTP(10 mM),0.5μl;CAF/CAR,各 0.5μl;ExTaq酶,0.25μl;Template,1 μl;ddHσ2O,19.75μl;总体积,25μl。反应条件为:94℃预变性4 min,然后进入循环,94℃变性30 s,56℃退火 30 s,72℃延伸 60 s,共 30个循环,最后72℃延伸5 min,1%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像系统观察结果。

1.7 药敏测定

采用纸片扩散K-B法,依CLSI2006年标准判读结果。

2 结果

2.1 419份临床标本包括痰、腹水、尿、阴拭子、血液等,结果显示从痰标本中分离出的肺炎克雷伯菌最多312株占74.46%,其次是尿液36株占8.59%,具体分布情况见表1。419株肺炎克雷伯菌中产ESBLs菌株191株,占45.58%。

表1 419株肺炎克雷伯菌在临床标本中的分布

2.2 I类整合子基因检测 对191株产ESBLs肺炎克雷伯菌进行 I类整合酶基因检测,结果有178株菌扩增出491 bp左右的扩增产物,和文献报道intI1片段大小相符[5],确定为I类整合子阳性菌株,检出率为93.2%。部分样本电泳见图1,其中6#为阳性对照,1#为阴性对照,其他4份标本均为产 ESBLs肺炎克雷伯菌。

图1 I类整合子基因检测PCR凝胶电泳图

2.3 I类整合子阳性菌株与细菌耐药的关系 对比I类整合子阳性菌株与阴性菌株对抗菌药物的耐药率,并做统计分析,结果见表2。除亚胺培南均敏感外,I类整合子阳性菌株对头孢曲松、哌拉西林、丁胺卡那霉素和头孢噻肟的耐药率均在88%以上,其中氨苄西林的耐药性达到100%,对头孢他啶、环丙沙星、复方磺胺甲硝唑、四环素、左氧氟沙星、氨曲南、和头孢噻肟的耐药率也高于55%,而I类整合子阴性菌株对它们的耐药率大多数都低于30%,有些甚至低于10%,如头孢他啶、头孢吡肟、妥布霉素等第3、4代头孢菌素。

表2 I类整合子阳性及阴性产ESBLs克雷伯菌耐药表型比较

3 讨论

ESBLs是近年来国际上研究较为活跃一种重要的酶[5,6]。ESBLs大多数由 TEM-1,TEM-2及 SHV-1发生突变的衍生物,能水解青霉素类、头孢菌素类及单酰胺类,能被克拉维酸等酶抑制剂所抑制,对头霉素类及碳青霉烯类敏感。作者从419株临床标本分离的肺炎克雷伯菌中检出191株产ESBLs KP,检出率高达45.58%,与国内文献报道基本一致[7]。可见随着近年来大量新广谱抗生素,特别是第三代头孢菌素的使用率增高,肺炎克雷伯菌的产ESBLs酶的比率呈现越来越高的趋势,应引起重视。

整合子介导的多重耐药机制引起耐药基因高效、快速转移而备受重视。它作为一种可移动基因元件,通过整合酶的作用,捕获外来的耐药基因(包括对氨基糖苷类、喹喏酮类、磺胺和消毒剂等耐药的基因)。整合子-基因盒系统是新的可移动基因元件,能捕获和整合细菌的耐药基因,是细菌多重耐药形式和传播的主要内在机制[8-10],而抗菌药物的选择压力是导致细菌耐药性存在、发展的主要客观因素,也向临床治疗多重耐药菌株提出了严峻的挑战。JONES等[11]发现耐药性可通过转化转移给大肠埃希菌,说明整合子可由质粒携带。杜艳等[12]研究认为克雷伯菌的多重耐药与I类整合子密切相关。表明I类整合子广泛地存在产 ESBLs肺炎克雷伯菌中,携带I类整合子的细菌更易表现出对氨基糖苷类、喹诺酮类及头孢菌素类药物的耐药性。说明整合子对细菌耐药性的播散确实有一定的作用,因此,整合子系统介导的细菌耐药机制越来越引起研究者们的关注,其中对多重耐药性的研究有着非常重要的意义[13]。

从表2可以看出,产 ESBLs菌株对抗生素的耐药率大部分均高于不产ESBLs菌株,并且与喹诺酮类、氨基糖苷类等多种抗生素存在交叉耐药。这是由于ESBLs的耐药基因常由可结合性大质粒编码,可携带对喹诺酮类、氨基糖苷类等多种抗生素的耐药基因形成具有多种耐药表型的泛耐药菌[14]。样品中产ESBLs株耐药率极高,除对亚胺培南和头孢西丁外几乎对其他所有抗菌药物均耐药,哌拉西林/他唑巴坦具有很强的抗菌作用,本组耐药率为43.3%,可能是由于他唑巴坦对 ESBLs酶有灭活作用,在与哌拉西林联用时,增强了哌拉西林的作用[15]。

头孢菌素中以头孢吡肟抗菌作用最强,原因可能是因为第4代头孢菌素对β-内酰胺酶亲和力较低,应用时间较短,且能快速地通过细菌的外膜屏障与PBP结合而发挥较强的抗菌作用[16],本组耐药率为44.3%;头霉类抗生素对肺炎克雷伯菌的抗菌活性优于第一、二代头孢菌素和多数三代头孢菌素,本组头孢西丁耐药率为2.9%,这可能与其含有对ESBLs酶相对稳定的7-α甲基侧链有关[17]。亚胺培南仍是所有被测药物中对肺炎克雷伯菌抗菌作用最强的抗生素,本组191份菌株对亚胺培南均敏感。可见对产酶肺炎克雷伯菌的临床经验性用药一般首选碳青霉烯类,其次是β-内酰酶类抗生素和酶抑制剂、头霉类抗生素及其他敏感抗生素。

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ESBLs producing K lebsiella pneumoniae strains with class I integron Correlation

GUO Hong-yang,ZHU Guang-ze,LIAN Shu-lin.
(The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun130021,China)

Objective T o understand the resistance and the characteristic of class 1 integron carried by K.pneumoniae from different samples,and elucidate the statusof gene cassettes.Methods Routine method was used to isolate K.pneumoniae;identified by V ITEK;Antibiotic suscep tibilitywas tested with the K-B diffusion method;Class 1 integrons were detected by PCR.Results ClassⅠintegron gene was found in 93.2%of 178 strains of ESBLs-producing K lebsiella pneum onia.The positive strains of classI integrons showed higher multidrug resistance to aminoglycosides and/or fluoroquinolones and/or cephalosporins than the negative strains of classI integrons.Conclusion ClassI integrons were p revalent in ESBLs-producing K lebsiella pneum onia and played an important role in the development and dissemination ofmultidrug resistance.

K lebsiella pneum onia;ESBLs;Integrons;Multidrug resistant

R378.99+6< class="emphasis_bold">文献标识码:A

A

1007-4287(2010)07-1097-03

2008-10-13)