生物技术在国兰中的应用

蒋 彧,叶兰香,,何俊蓉*,王海娥,卓碧萍,刘 菲,熊学琴

(1.四川省农业科学院园艺研究所,四川 成都 610066;2.西南交通大学,四川 成都 610031)

中国兰花,亦称国兰,通常指兰科兰属植物中一部分地生种类,包括春兰(Cymbidium goeringii)、蕙兰(C.faberi)、建兰 (C.ensifolium)、墨兰 (C.sinense)、寒兰 (C.kanran)、莲瓣兰 (C.tortisepalum)和春剑(C.tongibracteatum)等 7个种[1]。洋兰相对于中国兰而言,兴起于西方,主要指一些大花型附生种类,如卡特里亚兰(Cattleya Ld l.)、大花蕙兰(C.hybridum)、蝴蝶兰(Phalaenopsis Bl.)等[2]。与洋兰花朵硕大、色彩艳丽相比,国兰虽然花小、花少,但色彩清雅并具有独特的香味,深受各国兰友的喜爱,具有广阔的市场前景与价值。

近年来,与洋兰的工厂化、市场化程度相比,国兰发展较为缓慢,其生产技术水平有待提高。因此,对国兰的生物技术研究显得格外重要和引人注目。本文对生物技术在国兰中的应用进行综述,旨在对国兰的产业化和规模化生产提供理论依据。

1 组织培养技术

国兰在自然状态下繁殖困难,传统的分株繁殖周期长且繁殖率低。我国国兰组培始于 20世纪 60年代后期,经过多年的探索与研究,国兰组培技术正在不断地完善与创新。目前春兰、建兰、蕙兰、墨兰、寒兰等国兰组培已获得成功。国兰组织培养主要从两方面进行,即通过种子非共生萌发及茎尖、侧芽和花芽等外植体培养[3]。

1.1 种子非共生萌发

兰花种子体小量多,且不具备发育完整的胚,自然条件下很难萌发。研究发现,在自然条件下兰花种子需要真菌感染才能萌发,将兰花种子通过无菌进行萌发的方式,为非共生萌发法[4]。Bernard利用眉兰属 Ophrys L.的块茎配制培养基,成功获得卡德丽亚兰与蕾丽亚兰杂交种子萌发苗,开创了非共生萌发的先例[5]。随着兰花产业的发展,多利用非共生萌发来进行国兰的培育。董芳等研究表明,在培养基中添加真菌诱导子可促进春兰组培物生长量的增加及不定芽的分化[6]。黄磊等用春兰和大花蕙兰的杂交种子,经非共生萌发得到了无菌试管苗[7]。许多实验证实,在国兰种子的非共生萌发中,播种前对种子进行适当处理可以提高种子的萌发率。李丽等发现,改良的 1/2MS基本培养基有利于春兰种子的萌发;激素对其影响差异不明显;用10%NaClO(5%活性氯)溶液预处理 20 min～30 min,对种子萌发作用明显[8]。

1.2 外植体培养

春兰、墨兰、建兰均可用茎尖诱导出大量的类原球茎,类原球茎发育成根状茎后进一步长成幼苗[9,10]。在墨兰中有报道采用花芽等为外植体,但花芽诱导困难。叶片是比较理想的外植体材料,其中以试管苗的幼叶作为外植体培养较好。陈丽等从幼叶的叶尖表皮细胞和叶肉细胞直接培养出体细胞胚,但在 30 d之内无愈伤组织产生,在经过下一级的培养后分化出幼苗[11]。根作为外植体大多采用根尖为材料,相继在不同兰花中获得成功[12]。另外,还有用花梗作为外植体,但多用于洋兰,国兰中很少使用。王求清等用春兰成年植株的根状茎成功诱导出完整植株[12]。培养基的选择,激素等添加物和外界条件尤为重要。在原球茎的诱导阶段,加生长素如 NAA和细胞分裂素对原球茎的诱导有利,加细胞分裂素对原球茎的分化有促进作用;生根诱导时只需生长素即可[13]。吕永杰等认为,在兰花的整个生产过程中,利用半同体培养或液体培养进行原球茎增殖,利用同体培养分化和生根,可增加繁殖系数,降低污染,减少成本,有利于大规模生产[14]。

2 分子标记技术

由于分子标记与传统应用的常规遗传标记相比具有诸多优点,部分标记在兰花遗传育种中已得到广泛应用。现将分子标记在国兰育种中的应用情况概述如下:

2.1 遗传图谱的构建

遗传图谱的构建是在分子水平进行育种的依据。由于兰科植物变异很大,中间类型多,种的界限不清楚,构建兰科植物的遗传图谱,可进一步应用于品种鉴定、遗传多样性分析、基因定位、植物基因组作图等。谢伟等利用随机扩增多态 DNA技术(RAPD)对兰属的 3个品种春兰、春剑、惠兰进行了分析与研究,建立了它们之间的 DNA指纹图谱,找到了参试样品的特征谱带,并探讨它们之间的亲缘关系[15]。

2.2 遗传多样性和物种亲缘关系

遗传多样性是物种长期进化的结果,这对人工培育新型兰花品种,提高兰花质量等工作指明了一个方向。其中,RAPD技术多用于评价和比较种内、种间遗传变异。谢伟等利用 RAPD技术对兰属 7个种的 9个品种的遗传多样性和亲缘关系进行分析。选择 6个引物检测 64个位点的多态性,结果有 61个位点为多态性位点,占总位点数的 95.3%;而聚类分析则表明其亲缘关系与传统的形态学分类结果基本一致[16]。

2.3 品种图谱构建及杂种纯度鉴定

兰花品种繁多,还有大量的人工培育的中间种和变异植株。因此,可以根据分子标记的品种图谱构建来进行鉴定和分析。胡薇等应用 RAPD标记对建兰 38个品种的分析表明,支持将建兰分为彩心和素心两个变种,且素心由彩心变异而来。另外,研究发现一些品种的特异标记,如引物 S38-800 bp位点缺失是“马耳四季”的特异标记[17]。

2.4 分子标记辅助育种选择

变异、杂交和环境等结果使得兰花在育种表型选择时,具有不确定性。利用分子标记辅助育种选择,可实现目的基因的选择、转移和累积以减短育种周期。其前提则是需要足够的可行的识别位点,且与标记位点连锁紧密。目前,兰花是利用分子标记辅助育种相对比较多的一种。

3 基因工程技术

外源基因导入法改良兰花品种在许多洋兰上已经获得成功,但在国兰品种改良上,还少见报道,国兰植物转基因研究发展较为缓慢。国兰的遗传转化体系已经建立[18],但几乎所有研究的转化效率相对较低,一是兰科植物对根癌农杆菌或发根农杆菌不敏感,缺乏合适的载体,二是国兰再生体系建立的难度较大,目前几乎没有从国兰脱分化再生植株的报道,即便有愈伤组织的产生,增殖率也很低,继代培养后趋于坏死[19]。孔凡龙初步建立了一套适合于春兰的遗传转化体系,转化材料通过了染色和检测,说明基因已经整合到春兰的基因组中[20]。YangHH等成功地克隆了惠兰花叶病毒外壳蛋白基因,用电子枪轰击法将这一基因导入兰花的原球茎和愈伤组织,得到了较高的转化表达[21]。

4 前景与展望

随着我国生物技术的发展,国兰生产的前景将更为广阔。组织培养是兰花繁殖培育、工厂化生产的重要手段,但目前国兰的组培相对于洋兰还有很多技术急需改进和发展,如国兰的试管苗移栽后生长缓慢和开花迟的问题以及兰花共生菌根及其应用问题。建立和利用兰花分子标记技术,对国兰进行分类鉴定,研究其遗传多样性,弄清其品种间的亲缘关系,为兰花杂交、诱变和基因工程育种提供早期的辅助选择指标。同时也可采用基因工程技术创建符合大众审美观的转基因兰花。例如,可通过转基因技术将控制热带兰花色的基因导入国兰中,形成兼有花色花香的新种类。也可以将萤火虫的荧光基因与 ATP水解酶基因一起转化国兰,并与化学调控技术相结合使国兰接受自然灯光后在黑暗条件下闪闪发光,而成为“夜光国兰”。另外国外对一些热带兰品种进行染色体加倍处理,使之成为多倍体,显著地提高了其观赏价值和商品价值。中国兰花为二倍体植物,经染色体加倍后,也将会有奇花异卉产生。总之,用现代生物技术手段来武装我国尚且落后的国兰生产十分必要,是我国兰花生产在世界花卉市场上占有一席之地的重要保证。

[1] 陈心启,吉占和.国兰、洋兰三百问[M].北京:中国林业出版社,1996:108～109.

[2] 赵九洲.洋兰生物技术研究及其应用[J].北方园艺,2005,(4):77～78.

[3] 丁燕芬,王岩,龙春林.中国兰花组织培养研究进展[J].安徽农业科学,2007,(8):2247～2248.

[4] BEMARD N.Sur la gem ination du neottia nidus-avis compt[J].Rend Acad＆Sci Paris,1899,(128):1253～1255.

[5] Bernard N.Levolution dans la symbiose les orchidèes et leurs champignons commensaux[J].Ann SciNat Bot Ser,1909,(9):1～196.

[6] 董芳,赵建娜,刘红霞.真菌诱导子对春兰组培物生长的影响[J].北方园艺,2008,(5):194～196.

[7] 黄磊,贺筱蓉,郑立明.促进兰花组培苗生长的墨兰菌根真菌研究初报[J].2004,25(1):36～38.

[8] 李丽,罗君琴,王海琴.春兰种子非共生萌发的研究[J].福建热作科技,2007,(3):13～14.

[9] 孙志栋,陈惠云,葛红.中国春兰组织培养初探[J].安徽农学通报,2006,(1):20.

[10] 姜玲,张明涛,陈泽雄.墨兰组织培养结合化学处理脱除建兰花叶病毒(CymMv)的研究[J].园艺学报,2005,(6):1056～1060.

[11] 陈丽,潘瑞炽,陈汝民.墨兰原球茎生长的研究[J].热带亚热植物学报,1999,(1):59～64.

[12] 王求清,余通平.春兰根状茎离体培养[J].园艺学报,2005,(32):706～707.

[13] 段金玉,谢亚红.在无菌条件下激素和种了处理对兰属十种植物种子萌发的影响[J].云南植物研究,1982,(2):197～201.

[14] 吕永杰,李仕贵,周晓禾.观赏兰科植物组培快繁及遗传转化的研究进展[J].中国生物工程杂志,2003,(10):42～46.

[15] 谢伟,乐超银,郭政宏.兰花基因组 DNA多态性 RAPD分析[J].湖业农业科学,2006,(1):24～26.

[16] 谢伟,乐超银,林直.兰属品种的 RAPD鉴定和亲缘关系分析[J].江苏农业学报,2005,(4):369～373.

[17] 潘晓华.建兰 38个品种的 RAPD分析[J].园艺学报,2008,(2):289～294.

[18] Yang J,Lee H,Shin DH,et al.Genetic transformation of Cymbidium orchid by partical bombardment[J].Plant Cell Reports,1999,(18):978～984.

[19] Roy J,Banerjee N.Induction of callusand plant regeneration from shoot-tip explantsof Dendrobium fimbriatum Lindl.Var.oculatum Hk.F[J].Scientia Horticulturae,2003,(97)333～340.

[20] 孔凡龙.春兰的组织培养与遗传转化的初步研究[D].浙江大学,2008.

[21] Yang Hun-cheng,Chua NH.兰花色素生物合成基因的分离与特征[C].第 13届世界兰花大会论文集,1990.